曾 茜， 陳 旭， 楊 雨， 王曉敏， 李玉平

(1.貴州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所， 貴陽 550006；3.貴州大學農(nóng)學院食用菌研究院， 貴陽 550006)

食用菌營養(yǎng)豐富，健康美味，市場前景廣闊，成為最具發(fā)展優(yōu)勢的產(chǎn)業(yè)之一，具有“短平快”和“長遠穩(wěn)”等特點，特別是利益聯(lián)結(jié)機制緊密，能有效實現(xiàn)農(nóng)民增收，提升農(nóng)村產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展能力，扶貧效益顯著。食用菌產(chǎn)業(yè)在我國極具特色經(jīng)濟發(fā)展?jié)摿Γ艿礁鹘绺叨汝P(guān)注，在全國592個國家級貧困縣中約占72%，即426個縣選擇發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)，其中有三成的貧困縣年產(chǎn)值超過1億元，解決了2 000余萬的農(nóng)村人口就業(yè)問題[1-2]。香菇(Lentinulaedodes)的人工栽培起源于我國，是世界第二大生產(chǎn)菇類，2018年全國出產(chǎn)香菇突破1 000萬t，占食用菌總產(chǎn)量1/4以上，遠超于其他種類食用菌[3]。靈芝(Ganodermalingzhi)作為我國的名貴中藥材，廣譜的藥用價值及顯著生物活性已獲得消費者普遍認可，靈芝入藥首載于公元前二世紀的《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中將收載的365種藥品分為上、中、下三品，上品藥皆為有效無毒者，靈芝位列上品[4]。貴州立體多樣的氣候優(yōu)勢為發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)提供了有利條件，特別是實現(xiàn)香菇不同區(qū)域周年化供應(yīng)，并且2019年國家衛(wèi)健委和國家市場監(jiān)管局將靈芝列為既是食品又是中藥材物質(zhì)進行管理，貴州作為生產(chǎn)試點之一，對本地靈芝產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。然而，在上述兩種食用菌生產(chǎn)規(guī)模不斷壯大的同時，病蟲害的頻繁發(fā)生與傳播，特別是發(fā)展林下經(jīng)濟仿生態(tài)種植模式中菌棒及子實體污染問題，嚴重制約了產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[5-6]。

植物內(nèi)生真菌(Plant endophytic fungi)是指在植物宿主中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌，它是生活在植物組織內(nèi)的一類微生物，具有極其豐富的多樣性，并能與宿主協(xié)同進化，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[7]。Strobel[8]總結(jié)多年對內(nèi)生菌的研究發(fā)現(xiàn)，在特殊微環(huán)境中生長的內(nèi)生菌往往能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)更為新穎且具有特殊生物活性的化合物，是一個豐富的，非常有價值的資源寶庫。近年來，隨著對不同植物內(nèi)生真菌資源的不斷開發(fā)和探索，越來越多結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次級代謝產(chǎn)物被實際應(yīng)用到醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等方面，并且利用植物內(nèi)生真菌本身及其次生代謝產(chǎn)物作為農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治的新方法正在逐漸成為研究熱點[9-10]。因此，以前期對貴州地區(qū)小白及內(nèi)生真菌資源的分離鑒定和活性初篩為基礎(chǔ)，選擇表現(xiàn)出廣譜抗病活性的菌株GZFJ 015，進一步對香菇和靈芝菌棒病原菌的抑制活性進行研究，以期為食用菌病害生物防治新途徑的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試驗菌株

內(nèi)生菌GZFJ 015，結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定為毛殼屬(Chaetomiumsp.)真菌。采集分離自貴州銅仁梵凈山國家自然保護區(qū)野生小白及植株的根部，現(xiàn)保存于貴州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)部微生物實驗室。

1.1.2供試病原菌

3株香菇病原菌采集分離自銅仁市印江縣仿生態(tài)種植香菇發(fā)病菌棒，分別為XG 1(Pyriculariasp.)、XG 2(Alternariasp.)、XG 3(Phytophthorasp.)；3株靈芝病原菌采集分離自黔東南州丹寨縣仿生態(tài)種植靈芝發(fā)病菌棒，分別為LZ 1(FusaHumsp.)、LZ 2(Alternariasp.)和LZ 3(Thanatephorussp.)，以上病原菌均保存于本實驗室。

1.1.3主要培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基(改良沙氏培養(yǎng)基)均參照Zheng等[11]的方法配制。

1.1.4主要試劑

50%多菌靈可濕性粉劑。

1.2 方 法

1.2.1內(nèi)生菌GZFJ 015液體發(fā)酵

配制內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基，取規(guī)格為500 mL三角瓶裝液200 mL。在超凈臺中接入大小為5 mm的試驗菌株菌餅，置于28 ℃條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)10 d，轉(zhuǎn)速150 r·min-1。將獲得的發(fā)酵物5 000 r·min-1離心5 min，棄去菌絲體，取上清液，備用。

1.2.2內(nèi)生菌GZFJ 015抗食用菌病原菌活性測定

檢測方法參照何勁等[12]的抑制菌絲生長速率法。將離心后的發(fā)酵上清液用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，再以無菌發(fā)酵液∶PDA培養(yǎng)基=0.5∶9.5(體積比)的比例充分混勻，倒入平板培養(yǎng)皿中制成5%的帶藥培養(yǎng)基；采用未接入試驗菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基與PDA混合制得空白對照平板，設(shè)為ck組。在超凈工作臺上進行無菌操作，利用打孔器取直徑5 mm的供試食用菌病原菌的菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，置于28 ℃下培養(yǎng)10 d，每個處理設(shè)置5個平行對照，觀察各組病原菌菌絲生長情況，利用十字交叉法測量菌落直徑(D)，計算菌絲生長抑制率。

抑制率(%)=[(Dck-D實驗)/(Dck-5)]×100%。

1.2.3內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液毒力(EC50)測定

利用抗菌活性測定方法，取GZFJ 015菌株發(fā)酵液，制成含發(fā)酵液濃度分別為0、1.00、5.00、25.0、125.0、300.0、602.5μL·mL-1的PDA平板，計算抑制率。利用DPS和SPSS統(tǒng)計軟件，采用劑量對數(shù)-抑制率機值法計算EC50，即根據(jù)設(shè)定的發(fā)酵液濃度對數(shù)(x)和對應(yīng)的菌絲生長抑制率的概率值(y)，獲得發(fā)酵液對食用菌病原菌菌絲生長的毒力回歸方程y=a+bx以及相關(guān)系數(shù)(r)，從而計算抑制菌落擴展的有效中濃度EC50，同時以50%多菌靈可濕性粉劑作為陽性對照，設(shè)置濃度分別為0、1.00、5.00、25.0、100.0、1 000.0μg·mL-1[13]。

1.2.4內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液穩(wěn)定性測定

以靈芝菌棒病原菌LZ 2作為指示菌，參照何愛蓮等[14]的方法，對菌株GZFJ 015發(fā)酵液熱穩(wěn)定性進行檢測，將發(fā)酵濾液分別在40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和120 ℃條件下處理30 min，以常溫下保存的發(fā)酵濾液作為ck，參照何勁等[12]的方法進行抗菌活性的檢測。同時，對菌株GZFJ 015發(fā)酵液的酸堿度穩(wěn)定性進行檢測，利用適宜濃度的HCl和NaOH溶液，將發(fā)酵濾液pH值調(diào)至3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00和11.00，檢測不同酸堿度條件下發(fā)酵液的抗病原菌活性，方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 對食用菌病原菌菌絲的抑制作用

如圖1所示，與ck培養(yǎng)基平板相比，帶藥培養(yǎng)基(5%發(fā)酵液)平板對食用菌菌棒的6種病原菌菌絲生長均表現(xiàn)出較強的抑制作用，可觀察到帶藥培養(yǎng)基上的病原菌菌絲稀疏、萎縮，甚至逐漸凋亡。其中，菌株XG 2、LZ 2和LZ 3表現(xiàn)為菌絲邊緣產(chǎn)生純白色粉末或顆粒狀物質(zhì)，而菌株XG 1、XG 3和LZ 1則是菌絲頂端或周圍產(chǎn)生透明氣泡。通過計算，帶藥培養(yǎng)基對幾種病原菌菌絲生長抑制率均達到66.4%以上，LZ 2和XG 1的作用最強，分別為85.1%和83.8%，且相互間差異不顯著(p<0.05)，LZ 1和XG 2的效果次之，抑制率均超過70%。

2.2 內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液毒力(EC50)

采用生長速率法測定了小白及內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵上清濾液對6種食用菌菌棒病原菌菌絲生長的毒力(見表1)。結(jié)果表明，發(fā)酵液作用于不同供試病原菌均表現(xiàn)出較強的抑制活性且有所差異，其濃度與菌絲生長毒力呈正相關(guān)關(guān)系，對病原菌XG 1、XG 2、XG 3、LZ 1、LZ 2、LZ 3的EC50分別為11.84、77.91、6.28、29.65、13.72、48.23μL·mL-1。其中，以抑制香菇菌棒病原菌XG 3的毒力最大，為香菇菌棒病原菌XG 2的12.41倍，表明不同病原菌對發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的敏感性存在顯著差異。并且，與ck多菌靈相比，內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液對病原菌XG 3、LZ 1、XG 2和LZ 3具有更強毒力。

表1 內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液對6種食用菌病原菌菌絲的室內(nèi)毒力Table 1 Effects of GZFJ 015 fermentation broth on the indoor virulence of hyphae of pathogens from 6 kinds of edible fungi

2.3 內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液穩(wěn)定性

2.3.1內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液經(jīng)40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和120 ℃條件處理，以常溫下的發(fā)酵液作為ck，檢測其對香菇菌棒病原菌GX 3菌絲生長的抑制率，分別為75.5%、69.3%、72.3%、27.9%、3.1%及ck組72.6%(見圖3)。其中，100 ℃處理下的發(fā)酵液抑制率顯著降低(p<0.05)，在120 ℃時基本失去活性，說明高溫處理對發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的影響較大。但在80 ℃以下時，發(fā)酵液的抑菌活性趨于穩(wěn)定，保持在72.3%～75.5%之間，相互間差異不顯著，表明抑菌物質(zhì)對中低溫不敏感。

2.3.2內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液酸堿度穩(wěn)定性

內(nèi)生菌GZFJ 015發(fā)酵液在pH值為6.0～11.0范圍內(nèi)對香菇菌棒病原菌GX 3菌絲生長抑制效果較好且相對穩(wěn)定，抑制率在70.6%～74.1%之間(見圖4)，說明其中抗菌活性物質(zhì)的酸堿耐受范圍較廣，且略偏堿性。而當pH值在3.0～5.0范圍內(nèi)，隨著酸性增強其發(fā)酵液抑菌活性顯著下降(p<0.05)，pH值為4.0和3.0時，抑制率分別降至44.3%和8.9%，表明其中抗菌物質(zhì)對中強酸環(huán)境敏感。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生真菌作為一個發(fā)現(xiàn)時間短，生境特殊的微生物類群，存在許多尚未被鑒定的新種。由于內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的微環(huán)境中，與之發(fā)生協(xié)同進化，在演化過程中兩者形成了互惠關(guān)系，一方面植物為內(nèi)生真菌提供了生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物能刺激宿主植物生長發(fā)育，提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。因此，內(nèi)生真菌不僅能參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成或轉(zhuǎn)化，而且自身還擁有獨特的代謝系統(tǒng)和防御體系，具備產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)和特異功能活性物質(zhì)的潛力。因此，植物內(nèi)生真菌作為一個天然活性產(chǎn)物篩選的巨大寶庫越來越引起人們關(guān)注[15-16]。同時，處于生物多樣性豐富、競爭激烈環(huán)境下的植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性次級代謝產(chǎn)物的可能性更大，通過適當篩選，植物內(nèi)生真菌亦能成為農(nóng)業(yè)病害生物防治的重要資源庫，極具開發(fā)價值及應(yīng)用前景[17-18]。

我國是農(nóng)業(yè)大國，微生物源的病害每年都使農(nóng)作物產(chǎn)量遭受巨大損失，盡管控制的措施和方法多種多樣，但以化學藥物為主的殺菌劑在作物病害綜合防治中仍占主導地位。在實際生產(chǎn)中，采用農(nóng)業(yè)防治和生物防治病蟲害具有一定的局限性，由于資源條件有限、宣傳普及力度不夠、見效時間長等原因，綜合導致我國3 R(Resistance、Resurgence、Residue)問題日趨嚴重。因此，有針對性地開發(fā)更多具有抗病活性的微生物資源，拓寬作物病害生物防治新途徑，具有重要的理論意義和實際價值。本研究以內(nèi)生真菌GZFJ 015作為抗性篩選菌株，對分離獲得的香菇病原菌XG 1、XG 2、XG 3及靈芝病原菌LZ 1、LZ 2、LZ 3進行生防評價。結(jié)果表明，該菌株5%發(fā)酵液對各病原菌菌絲生長均具有較強的抑制作用，抑制率依次為83.8%、66.4%、71.5%、78.1%、85.1%及69.4%。通過觀察發(fā)現(xiàn)，帶藥培養(yǎng)基上的病原菌菌絲稀疏、萎縮，部分呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；其中，菌株XG 2、LZ 2和LZ 3表現(xiàn)為菌絲邊緣產(chǎn)生純白色粉末或顆粒狀物質(zhì)，而菌株XG 1、XG 3和LZ 1則是菌絲頂端或周圍產(chǎn)生透明氣泡。分析其原因，前者可能是菌落邊緣菌絲形態(tài)發(fā)生畸變，聚集成簇，出現(xiàn)扭曲集結(jié)的現(xiàn)象[19]，而后者則可能是病原菌細胞壁或膜結(jié)構(gòu)發(fā)生解體，原生質(zhì)滲漏，細胞產(chǎn)生自溶現(xiàn)象[20]。通過進一步毒力測定，獲得發(fā)酵液有效中濃度EC50值依次為11.84、77.91、6.28、29.65、13.72、48.23μL·mL-1，其中對病原菌XG 3、LZ 1、XG 2和LZ 3毒力效果優(yōu)于對照多菌靈。并且，發(fā)酵液的抑菌活性在80 ℃以下和pH值為6.0～11.0范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，高溫或中強酸性環(huán)境易導致活性下降。

綜上所述，小白及內(nèi)生菌GZFJ 015對仿生態(tài)栽培香菇和靈芝菌棒病害表現(xiàn)出較好的生物防治潛力，本研究已初步完成其發(fā)酵液對6種食用菌病原菌的毒力檢測以及部分穩(wěn)定性試驗。需進一步富集發(fā)酵產(chǎn)物，分離鑒定其中的有效活性成分，探索抗病機理，從而為生物農(nóng)藥資源的開發(fā)和新型抗生素的篩選奠定基礎(chǔ)。