劉 咪， 曾子欣， 徐 堯， 張 璇， 李銘潔， 孫 靜

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

牡丹(PaeoniasuffruticasaAndr.)為芍藥科芍藥屬牡丹組落葉灌木，是我國(guó)特有的植物資源，其9個(gè)野生原種均產(chǎn)于我國(guó)[1]。作為中國(guó)傳統(tǒng)名花，牡丹的花可供觀賞，根可作丹皮入藥，種子含有較高的不飽和脂肪酸，對(duì)人體具有重要的生理功能，是食用油的良好來源[2]。近年來，油用牡丹的栽培與深加工在國(guó)內(nèi)迅速發(fā)展，油用牡丹品種鳳丹具有出油率高、結(jié)籽多、易于管理等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。目前關(guān)于油用牡丹種子的研究主要集中在種子含油量、油脂改良、脂肪酸組成等方面[5-7]，對(duì)種子發(fā)育過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化變化的相關(guān)研究較少。在牡丹種子發(fā)育過程中，可溶性糖作為主要呼吸底物，是種子發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和重要的能量來源，同時(shí)也與油料種子脂肪酸合成和油脂累積過程密切相關(guān)[8]。內(nèi)源激素對(duì)發(fā)育各個(gè)階段都有重要的生理調(diào)控作用，多種激素的平衡對(duì)胚胎發(fā)育及種子萌發(fā)有重要影響[9]。同時(shí)種子干重、鮮重與種子含水率反映不同時(shí)期貯藏物質(zhì)的積累情況及種子飽滿程度[10]，是種子發(fā)育過程生理生化測(cè)定的重要指標(biāo)。

本研究以鳳丹為試驗(yàn)材料，對(duì)其種子發(fā)育進(jìn)行研究，分析不同時(shí)期種子含水率、糖類和內(nèi)源激素等含量及種子活力的變化，以期闡明不同發(fā)育時(shí)期牡丹種子糖類、內(nèi)源激素含量、含水率等與牡丹種子發(fā)育與形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，為油用牡丹種子適宜采收期的確定、生產(chǎn)利用和籽油開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

牡丹種子收集于江蘇省揚(yáng)州大學(xué)牡丹芍藥資源圃(32°32′N，119°24′E)。從牡丹花后第10天開始，每隔10 d取樣一次，直至120 d，共12個(gè)時(shí)期。一部分用于測(cè)定生理指標(biāo)及解剖觀察，另一部分于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1牡丹種子鮮重與含水量的檢測(cè)

將12個(gè)時(shí)期牡丹種子種莢剝掉，用蒸餾水洗凈自然風(fēng)干。稱取10粒種子的重量，稱量3次，再計(jì)算出單粒種子的重量，作為種子鮮重。然后放在烘箱中烘48 h，稱量3次，取平均值作為單粒種子干重。

1.2.2牡丹種子發(fā)育不同時(shí)期解剖結(jié)構(gòu)觀察

將盛花期后30 d、50 d、70 d的新鮮牡丹種子縱切，置于體式顯微鏡下觀察，拍照。配置10%濃度的I2-KI溶液，用于種子中的淀粉染色。同時(shí)，準(zhǔn)備濃度為2%的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染液，對(duì)種子縱切面進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞活力，凡被染為紅色的活力強(qiáng)，淡紅的次之，無色者為沒有活力的種子。

采取花后10 d的牡丹種子用刀片縱切兩半，分別切取種皮和胚乳1 mm×1 mm大小的方塊置于2.5%戊二醛溶液中固定2 h以上以備觀察。觀察前樣品用0.1 mol·L-1的PBS緩沖液沖洗3次，每次15 min，依次經(jīng)過50%、70%、85%、95%、100%酒精梯度脫水，每次15 min，丙酮和無水乙醇等體積混合液處理15 min，后經(jīng)CO2臨界點(diǎn)干燥，噴金，將其置于掃描電鏡(XL-30 ESEM，荷蘭Philips公司)下觀察其發(fā)育狀態(tài)。

1.2.3牡丹種子中糖類物質(zhì)的檢測(cè)

總糖含量測(cè)定參照植物總糖含量試劑盒(上海索橋生物科技有限公司)說明書進(jìn)行；蔗糖、葡萄糖、果糖含量的測(cè)定參照試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。

1.2.4牡丹種子中植物激素的檢測(cè)

取花后30 d、50 d、70 d的牡丹種子，用清水漂洗數(shù)次，吸水紙將表面水分吸干，放于液氮中迅速研磨，稱取0.1 g粉末于EP管中，加入5 mL 80%甲醇水提液，在4 ℃冰箱里放置一夜。過夜避光浸提后，提取液用高速離心機(jī)在低溫4 ℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1。離心后，將上清液吸入新離心管中，加入200μL提取液，4 ℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1，此過程重復(fù)一次。依次用10 mL純乙醇，20 mL超純水，10 mL 80%甲醇通過裝有提取液的C 18萃取小柱，活化柱體。色譜條件：C 18(100×2.1 mm， 3μm)色譜柱，流動(dòng)相：0.1%甲酸水-乙腈溶液，線性梯度洗脫：0～1 min, 5%乙腈；1～3 min， 5%～60%乙腈；3～6 min, 60%～95%乙腈；6～7 min，95～5%乙腈；7～10 min，5%乙腈，流速300μL·min-1，柱溫25 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣量5μL，分析時(shí)間10 min。

各激素檢測(cè)質(zhì)譜條件為：電子噴霧離子源(ESI)，溫度600 ℃；多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)；氣簾氣壓25 psi，離子化電壓-4 500 V，噴霧氣壓為55 psi，輔助加熱氣壓為55 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹種子發(fā)育不同時(shí)期鮮重、干重和含水量的變化

從表1可以看出，隨著發(fā)育天數(shù)的增加，牡丹種子鮮重和干重變化趨勢(shì)基本一致，均呈先升高后減少的趨勢(shì)，花后30～50 d，種子鮮重、干重增重較快，這是種子發(fā)育初期胚乳逐漸形成階段，物質(zhì)積累最快的時(shí)期。開花50 d以后，種子增重較緩慢，成熟期(花后100 d)趨于穩(wěn)定?；ê?0 d時(shí)，種子略小，含水率最大，達(dá)91%，隨后種子含水率逐漸降低。在100 d時(shí)單粒鮮重和干重達(dá)到最大，分別為0.57 g和0.31 g，含水率降低到46%?；ê?10～120 d時(shí)，種子鮮重略微降低，含水率有所升高。

表1 牡丹種子發(fā)育不同時(shí)期的重量變化

2.2 牡丹種子發(fā)育不同時(shí)期胚乳的結(jié)構(gòu)觀察

從圖1可以看出，牡丹種子分為種皮和胚乳兩個(gè)部分。中央胚乳在種子發(fā)育初期存在空腔，有透明液體充滿其中，花后30 d經(jīng)TTC染色試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)種子內(nèi)活力很強(qiáng)的部分(圖1 A)。花后50 d進(jìn)入胚乳細(xì)胞化(圖1 B)，內(nèi)部液體逐漸粘稠，細(xì)胞結(jié)構(gòu)初現(xiàn)，TTC染色呈紅色，表明此時(shí)胚乳內(nèi)細(xì)胞活力最為旺盛，與胚乳形成密切相關(guān)?；ê?0 d(圖1 C)，胚乳形態(tài)變得堅(jiān)硬，細(xì)胞活力減弱，胚狀結(jié)構(gòu)初現(xiàn)，種皮厚度減少。

I2-KI染色表明，牡丹種子內(nèi)存在淀粉，主要集中于種皮部位。種子發(fā)育30 d(圖1 D)，種皮較厚，I2-KI染色呈黑色，說明內(nèi)部存在淀粉。種子發(fā)育至50 d時(shí)(圖1 E)，種皮雖然變薄，但是內(nèi)部仍然有淀粉富集，I2-KI染色中心胚乳呈橘黃色，說明內(nèi)部具有大量蛋白質(zhì)合成。花后70 d時(shí)(圖1 F)，種皮被不斷充實(shí)的胚乳壓縮變薄，胚乳中心呈現(xiàn)藍(lán)紫色，說明出現(xiàn)少量淀粉。

2.3 牡丹種子花后第10天種皮的結(jié)構(gòu)觀察

牡丹種子發(fā)育第10天進(jìn)行縱切，使用掃描電鏡對(duì)縱切面進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)種皮占全種子的體積較大，此時(shí)種皮又分為表皮、柵欄層、貯藏薄壁細(xì)胞層。表皮結(jié)構(gòu)具有小突起，柵欄層僅有2層細(xì)胞圍繞，貯藏細(xì)胞層數(shù)較多，為種皮積累淀粉提供場(chǎng)所，在花后第10天，種子中心形成空腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)部充滿透明液體(圖2)。

2.4 牡丹種子發(fā)育過程中糖類相關(guān)物質(zhì)變化

檢測(cè)了牡丹種子發(fā)育30 d、50 d、

70 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的糖類含量變化(圖3)，發(fā)現(xiàn)總糖的含量在175～220 mg·g-1(鮮重)之間，呈先升高后趨近平穩(wěn)的狀態(tài)。蔗糖含量有先下降后升高的趨勢(shì)，30 d時(shí)蔗糖含量在40 mg·g-1(鮮重)左右，50 d時(shí)蔗糖含量略有下降，推測(cè)與此時(shí)胚乳的細(xì)胞化相關(guān)，到70 d時(shí)，蔗糖含量發(fā)生了明顯升高，達(dá)60 mg·g-1(鮮重)左右。葡萄糖的含量呈小幅度上升的趨勢(shì)，30 d時(shí)為82 mg·g-1(鮮重)，70 d時(shí)升高到100 mg·g-1(鮮重)。果糖的整體含量最低，含量上升緩慢，并不顯著。

2.5 牡丹種子激素含量變化

由圖4可見，牡丹種子內(nèi)Zeatin含量在花后30～70 d持續(xù)升高，花后70 d時(shí)最高，達(dá)到158.5μg(鮮重)，顯著高于IAA、GA3和ABA。GA3含量在種子發(fā)育過程中逐漸降低，由花后30 d的20.1μg·g-1(鮮重)降至花后50 d的9.7μg·g-1(鮮重)，又降至花后70 d的2.3μg·g-1(鮮重)。IAA含量由花后30 d的3.8μg·g-1(鮮重)升高至花后50 d的5.8μg·g-1(鮮重)，在花后50 d達(dá)到最高，而后趨于平穩(wěn)。ABA含量在花后30 d后顯著升高，花后50 d時(shí)達(dá)到最高，含量為0.25μg·g-1(鮮重)，隨后急劇下降，花后70 d時(shí)降至0.1μg·g-1(鮮重)，相對(duì)于Zeatin、GA3和IAA，ABA含量極低。由此推斷，牡丹種子生長(zhǎng)發(fā)育變化最顯著的時(shí)期為盛花期后30～50 d。

3 結(jié)論與討論

3.1 牡丹種子活力和含水量與種子發(fā)育的關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著牡丹種子不斷發(fā)育，胚乳細(xì)胞活性不斷增強(qiáng)，花后50 d活力達(dá)到最高，淀粉也在此時(shí)顯著富集在種皮區(qū)域，凹陷處不斷充實(shí)，有大量蛋白質(zhì)合成，說明胚乳開始積累貯藏物質(zhì)，牡丹種子形態(tài)和生理發(fā)育逐漸完善。之后種皮不斷變薄，淀粉逐漸降解，胚乳形態(tài)變硬，種子活力不斷減弱。研究認(rèn)為，種子活力受種子成熟時(shí)生理狀態(tài)的影響[11]，與貯藏物質(zhì)合成能力呈正相關(guān)，其活力下降時(shí)，合成速度也隨之下降[12-13]，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。種子含水量在種子發(fā)育過程中總體呈下降趨勢(shì)，其中在盛花期后20 d及70 d顯著下降，而種子鮮重、干重增加迅速，說明此時(shí)是牡丹種子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累的關(guān)鍵時(shí)期。種子發(fā)育第10天的掃描電鏡觀察表明，此時(shí)種子中間凹陷，存在空腔，空腔內(nèi)充盈漿液。認(rèn)為第20天后空腔內(nèi)開始積累貯藏物質(zhì)，種子含水量下降，種子成熟后含水量趨于平穩(wěn)，推測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累也在成熟時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

3.2 種子發(fā)育與糖含量的關(guān)系

可溶性糖主要包含果糖、蔗糖、葡萄糖等，作為種子發(fā)育過程中主要的呼吸底物，是碳水化合物代謝、貯藏、運(yùn)輸?shù)闹匾镔|(zhì)[14]，其含量一般隨著種子發(fā)育不斷上升，但由于自身和環(huán)境因素，也會(huì)呈下降趨勢(shì)，種子成熟后所需的糖一般由胚乳和胚貯藏的糖提供[15]。本研究中，牡丹種子發(fā)育早期可溶性糖含量先升高而后趨于平穩(wěn)，與種子鮮重、干重的變化呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，其中葡萄糖、果糖含量均逐漸升高。種子發(fā)育早期細(xì)胞分裂分化旺盛，葡萄糖是可溶性糖的主要組成部分，以滿足發(fā)育早期較高的能量需求，后期隨著蔗糖合成酶的高效表達(dá)，蔗糖含量不斷升高，用于油脂、蛋白質(zhì)等貯藏物質(zhì)的合成。本研究中，花后30～70 d的種子中葡萄糖含量顯著高于其他可溶性糖。而蔗糖含量在種子發(fā)育50 d降低后又顯著升高，種子發(fā)育初期可溶性糖含量變化不明顯，可能是由于種子發(fā)育初期各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化同時(shí)存在，生理過程較為復(fù)雜。

3.3 種子發(fā)育與內(nèi)源激素含量的關(guān)系

種子發(fā)育過程中，隨著種子形態(tài)的變化，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的貯藏和積累，種子內(nèi)源激素含量不斷發(fā)生變化。分析發(fā)現(xiàn)，各內(nèi)源激素在牡丹種子發(fā)育過程中出現(xiàn)峰值及起顯著作用的時(shí)期不同，說明這些激素在不同階段通過特定的作用影響種子的發(fā)育。Zeatin是細(xì)胞分裂素的一種，除了促進(jìn)細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)外，還具有加速胚乳物質(zhì)降解的作用[16]。本研究中種子發(fā)育50 d后，Zeatin含量顯著升高，推測(cè)這個(gè)階段胚乳形成，積累在胚乳中的淀粉逐漸降解有關(guān)?；ê?0～50 d，牡丹種子中IAA含量持續(xù)上升，發(fā)育至胚乳細(xì)胞化時(shí)期達(dá)到峰值，隨后趨于平穩(wěn)，種子IAA含量與種子活力呈顯著相關(guān)性。由此可見，IAA在牡丹種子發(fā)育前期對(duì)種子生理活性具有重要影響。劉仲齊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IAA具有調(diào)集營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向種子轉(zhuǎn)移，形成生長(zhǎng)中心的作用。本研究結(jié)果與之基本一致。ABA作為抑制植物生長(zhǎng)的激素可直接參與種子休眠、衰老等過程，也具有促進(jìn)胚正常發(fā)育成熟的功能，可以促進(jìn)某些貯藏物質(zhì)的積累[18]。本研究中，牡丹種子ABA含量在花后30～50 d顯著增加，胚乳形成后含量不斷減少，推測(cè)ABA在牡丹種子成熟期作用不大。GA3含量在種子花后30～70 d呈逐漸下降的趨勢(shì)，在胚乳形成和種子發(fā)育成熟過程中GA3作用不明顯。

種子發(fā)育受含水量、淀粉含量、糖含量、激素種類和含量等多種因素影響，這些因素彼此之間又存在著復(fù)雜的相互作用。本試驗(yàn)僅對(duì)牡丹種子盛花期后30～70 d發(fā)育過程中部分生理生化指標(biāo)進(jìn)行了初步測(cè)定與探究，關(guān)于各指標(biāo)之間更深入的相互作用以及在種子發(fā)育后期的變化還需進(jìn)一步探究。