高 敏， 藺偉虎， 田 沛

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730020)

土壤鹽漬化是影響世界農(nóng)業(yè)用地、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、影響植物生存和植物地理環(huán)境分布的重要因素[1-2]。全球約有9.5億hm2的土地受鹽漬化影響，而我國約有9 000萬hm2受影響，由于全球氣候變化和施肥灌溉等農(nóng)業(yè)措施的影響，預(yù)計土壤鹽漬化將持續(xù)增加[3-5]，因此研究鹽堿脅迫對植物生長發(fā)育的影響十分重要。

中華羊茅(Festucasinensis)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國西北、華北和青藏高原等地的常見野生牧草[6]，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、再生性和抗逆性強等優(yōu)點[7-8]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于中華羊茅種子萌發(fā)及幼苗生長的研究主要集中在內(nèi)生真菌[9-11]、溫度[12-13]、水分[14]、PEG[15]、酸堿條件[16]等對其影響上，關(guān)于中華羊茅鹽堿脅迫方面的研究主要集中在單鹽、單堿脅迫對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[17-19]，目前還沒有關(guān)于鹽堿混合脅迫對中華羊茅種子萌發(fā)及幼苗生長的研究。

種子萌發(fā)是植物生命周期中最重要也是最復(fù)雜的一個階段，同時也是植物對鹽堿脅迫最為敏感的階段[20]，該階段是決定植物能否在鹽堿環(huán)境條件下生存的關(guān)鍵時期[21]；植物種子在此時期的生長特征，也可以在一定程度上反映植物總體的耐鹽堿能力[22-24]。鹽堿脅迫是田間作物生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一，對作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[25]；過量的鹽分是直接干預(yù)種子萌發(fā)和作物充分發(fā)育的重要非生物因素，并且限制了作物的產(chǎn)量[26]；在鹽或堿條件下保持種子活力的能力，以及在這種脅迫減弱或消除后開始發(fā)芽的能力，是耐鹽和耐堿植物在極端非生物條件下存活的機制之一[27]。因此本試驗以中華羊茅種子為材料，研究中華羊茅種子在不同鈉鹽脅迫下的萌發(fā)特性及對不同鈉鹽脅迫的響應(yīng)，探究中華羊茅種子對鹽堿環(huán)境的耐受機理，為進一步耐鹽品種的選育與推廣利用以及鹽堿地的改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年將采自青海省平安縣古城鎮(zhèn)(36°50′N，102°10′E，海拔3 060 m)的中華羊茅種子播種在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗田中，2015年收獲種子。采集的種子4 ℃保存于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧草和草坪草種子質(zhì)量檢測和測試中心(蘭州)種子貯藏室備用。

1.2 試驗方法

2019年11月20日采用分析純NaHCO3和NaCl試劑配制NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液(NaCl和NaHCO3按物質(zhì)的量為1∶1進行混合)對中華羊茅種子進行脅迫培養(yǎng)。每種鈉鹽溶液分別設(shè)10個濃度梯度(10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mmol·L-1)。選取籽粒飽滿、大小一致且無病蟲害的中華羊茅種子用蒸餾水沖洗干凈，將種子置于直徑為9 cm鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中50粒種子，分別加入不同濃度的鈉鹽溶液5 mL，以蒸餾水培養(yǎng)作為對照，每個處理3個重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(溫度25 ℃，光周期為光16 h/暗8 h；光照強度5 000 lx)中進行培養(yǎng)。每天用稱重法補充失去的水分，保持處理液濃度恒定。按照國際種子檢驗規(guī)程[28]規(guī)定種子的發(fā)芽時間為14 d，以種子發(fā)芽長度超過1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天同一時間觀察并記錄種子的發(fā)芽數(shù)，第7天測定種子的發(fā)芽勢，14 d后發(fā)芽結(jié)束，統(tǒng)計種子發(fā)芽率等指標(biāo)，每個處理隨機挑選30粒發(fā)芽種子測量胚根長和胚芽長。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1種子萌發(fā)

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%，式中：n為最終正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子總數(shù)[28]；

發(fā)芽勢(%)=(種子發(fā)芽達高峰時的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%[29]；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[29]；

活力指數(shù)=GI×S，式中：GI為發(fā)芽指數(shù)，S為幼苗平均總長度(單位為cm)[29]；

根芽比=胚根長/胚芽長；

相對鹽害率(%)=[(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率]×100%[30]；

耐鹽指數(shù)(%)=(處理組種子發(fā)芽率/對照種子發(fā)芽率)×100%[31]。

1.3.2耐鹽濃度

為了確定中華羊茅種子耐鈉鹽適宜濃度，本試驗以種子發(fā)芽率作為鈉鹽脅迫適宜濃度指標(biāo)，對中華羊茅種子的發(fā)芽率進行線性回歸，確定中華羊茅對兩種鈉鹽脅迫的耐鹽濃度、半致死濃度和耐鹽極限濃度。

耐鹽濃度(適宜值)：試驗組達到對照組發(fā)芽率75%時對應(yīng)的鹽濃度[32]；

半數(shù)抑制濃度(臨界值)：試驗組達到對照組發(fā)芽率50%時對應(yīng)的鹽濃度[32]；

耐鹽極限值(極限值)：試驗組達到對照組發(fā)芽率25%時對應(yīng)的鹽濃度[32]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Microsoft Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及計算，以IMB SPSS Statistics 18.0統(tǒng)計分析軟件對不同指標(biāo)采用LSD法進行單因素方差分析和多重比較，設(shè)定顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鈉鹽脅迫對中華羊茅種子萌發(fā)的影響

2.1.1對中華羊茅種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液處理下，中華羊茅種子的發(fā)芽率均隨溶液濃度的升高呈先升高后降低的趨勢。NaHCO3溶液處理下，中華羊茅種子的發(fā)芽率在溶液濃度為10 mmol·L-1時達最大值，與對照和20 mmol·L-1處理下的種子發(fā)芽率無顯著差異，顯著高于其他濃度處理下的發(fā)芽率(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽率為0。混合溶液處理下，種子的發(fā)芽率在溶液濃度為30 mmol·L-1時達最大值(88.67%)，比對照高10.84%，但與對照間無顯著差異。當(dāng)溶液濃度超過30 mmol·L-1時，混合溶液處理下的種子發(fā)芽率顯著高于NaHCO3溶液處理下的發(fā)芽率(p<0.05)(圖1)。

不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅種子的發(fā)芽勢隨溶液濃度的升高均呈先升高后下降的趨勢。NaHCO3溶液處理下，溶液濃度為10 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽勢達最大值(53%)，顯著高于對照及其他濃度處理下的種子發(fā)芽勢(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為80 mmol·L-1、90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽勢為0?；旌先芤禾幚硐?，種子的發(fā)芽勢在30 mmol·L-1時達最大值(51.33%)，顯著高于對照及其他濃度處理下的發(fā)芽勢(p<0.05)；當(dāng)溶液溶度為90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽率為0。當(dāng)溶液濃度大于30 mmol·L-1時，混合溶液脅迫下中華羊茅種子的發(fā)芽勢均高于NaHCO3溶液脅迫下的發(fā)芽勢，且在30 mmol·L-1、60 mmol·L-1及70 mmol·L-1溶液處理下具有顯著差異(p<0.05)(圖1)。

2.1.2對中華羊茅種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅種子的發(fā)芽指數(shù)隨溶液濃度的升高均呈先上升后下降的趨勢。NaHCO3溶液處理下，溶液濃度為10 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽指數(shù)達最大值(27.49%)，顯著高于對照(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為30 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽指數(shù)為0?；旌先芤禾幚硐?，種子的發(fā)芽指數(shù)在溶液濃度為30 mmol·L-1時達最大值(28.65%)，顯著高于對照，但與10 mmol·L-1和20 mmol·L-1溶液處理下的發(fā)芽指數(shù)無顯著差異(p<0.05)。當(dāng)溶液濃度大于30 mmol·L-1時，混合溶液脅迫下的種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于NaHCO3溶液脅迫下的發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)(圖2)。

不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅種子的活力指數(shù)也呈先上升后下降的趨勢。NaHCO3溶液處理下，種子的活力指數(shù)在溶液濃度為10 mmol·L-1時達最大值(113.61%)，與20 mmol·L-1處理下的種子活力指數(shù)無顯著差異，但顯著高于對照及其他濃度處理下的種子活力指數(shù)(p<0.05)；溶液濃度為90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，種子的活力指數(shù)為0?；旌先芤好{迫下，種子的活力指數(shù)在溶液濃度為10 mmol·L-1時達最大值(115.41%)，顯著高于對照，但與20 mmol·L-1處理下的種子活力指數(shù)無顯著差異(p<0.05)。同一濃度下混合溶液處理的種子活力指數(shù)大于NaHCO3溶液處理下的種子活力指數(shù)，且在30 mmol·L-1、50 mmol·L-1、60 mmol·L-1及70 mmol·L-1下具有顯著差異(p<0.05)(圖2)。

2.2 不同濃度鈉鹽脅迫對中華羊茅胚根長和胚芽長的影響

不同濃度NaHCO3溶液脅迫下，中華羊茅的胚根長隨溶液濃度的升高逐漸降低，當(dāng)溶液溶度為30 mmol·L-1時，胚根長小于1 cm，溶液濃度為60 mmol·L-1、70 mmol·L-1、80 mmol·L-1、90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，胚根長為0。不同濃度NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅的胚根長隨溶液濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，溶液濃度為10 mmol·L-1時，胚根長達最大值(2.09 cm)，顯著高于對照及其他濃度下的胚根長(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為40 mmol·L-1時，胚根長顯著低于對照(p<0.05)；溶液濃度為80 mmol·L-1、90 mmol·L-1、100 mmol·L-1時，胚根長為0。溶液濃度相同時，混合溶液處理下的中華羊茅胚根長顯著高于NaHCO3溶液處理下的胚根長(p<0.05)(圖3)。

不同濃度NaHCO3溶液處理下，中華羊茅的胚芽長隨著溶液濃度的升高逐漸降低，對照與10 mmol·L-1溶液處理下的胚芽長無顯著差異，顯著高于其他濃度處理下的胚芽長(p<0.05)；溶液濃度為90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，胚芽長為0。混合溶液脅迫下，胚芽長隨著溶液濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，胚芽長在溶液濃度為10 mmol·L-1時達最大值，與對照和20 mmol·L-1處理下的胚芽長無顯著差異，但顯著高于其他濃度處理下的胚芽長(p<0.05)。溶液濃度為60 mmol·L-1、70 mmol·L-1、80 mmol·L-1、90 mmol·L-1、100 mmol·L-1時，混合溶液處理下的胚芽長顯著高于NaHCO3溶液處理下的胚芽長(p<0.05)(圖3)。

2.3 不同濃度鈉鹽脅迫對中華羊茅根芽比的影響

不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅的根芽比均呈先上升后下降的趨勢。NaHCO3脅迫下，溶液濃度為10 mmol·L-1時，根芽比高于對照，但與對照及20 mmol·L-1處理下的根芽比無顯著差異；溶液濃度大于60 mmol·L-1時，中華羊茅的根芽比為0?；旌先芤好{迫下，根芽比在溶液濃度為10 mmol·L-1時達最大值(0.48)，與20 mmol·L-1溶液處理下的根芽比無顯著差異，顯著高于對照及其他濃度處理下的根芽比(p<0.05)；當(dāng)溶液濃度為80 mmol·L-1、90 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，中華羊茅的根芽比為0。溶液濃度相同時，NaHCO3溶液脅迫下的根芽比顯著小于混合溶液脅迫下的根芽比(p<0.05)(圖4)。

2.4 不同濃度NaHCO3和NaCl+NaHCO3對中華羊茅種子耐鹽性的影響

2.4.1對中華羊茅種子相對鹽害率和耐鹽指數(shù)的影響

相對鹽害率反映了鈉鹽脅迫對種子的傷害程度。不同濃度NaHCO3溶液脅迫下，相對鹽害率在溶液濃度為100 mmol·L-1時達到最大值；濃度為10 mmol·L-1和20 mmol·L-1時種子并未受到毒害，反而表現(xiàn)為萌發(fā)促進作用。不同濃度NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，溶液濃度小于30 mmol·L-1時對種子的萌發(fā)有促進作用，濃度大于40 mmol·L-1時，相對鹽害率逐漸增大，當(dāng)溶液濃度為100 mmol·L-1時，相對鹽害率達最大值。溶液濃度相同時，NaHCO3溶液比NaCl+NaHCO3混合溶液對處于萌動狀態(tài)的種子傷害作用更大，且在溶液濃度大于30 mmol·L-1時具有顯著差異(p<0.05)(圖5)。

耐鹽指數(shù)反映了中華羊茅種子對鹽堿脅迫的耐受程度。不同濃度NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅種子的耐鹽指數(shù)均呈先上升后下降的趨勢。NaHCO3溶液脅迫下，種子的耐鹽指數(shù)在10 mmol·L-1處理下達到最大值，與對照和20 mmol·L-1處理下的耐鹽指數(shù)無顯著差異；30～80 mmol·L-1濃度下，耐鹽指數(shù)不斷下降，溶液濃度超過90 mmol·L-1時，種子的耐鹽指數(shù)為0。NaCl+NaHCO3混合溶液處理下，種子的耐鹽指數(shù)在溶液濃度為30 mmol·L-1時達最大值，顯著高于對照，但與10 mmol·L-1和20 mmol·L-1處理下的耐鹽指數(shù)無顯著差異(p<0.05)；濃度為100 mmol·L-1時，耐鹽指數(shù)下降到最小值，僅為對照的20.53%。溶液濃度大于30 mmol·L-1時，混合溶液處理下的耐鹽指數(shù)顯著高于NaHCO3溶液處理下的耐鹽指數(shù)(p<0.05)(圖5)。

2.4.2對中華羊茅種子耐鹽堿半致死濃度和耐鹽極限濃度的影響

NaHCO3溶液脅迫下，中華羊茅種子的耐鹽濃度、半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為36.91 mmol·L-1、57.09 mmol·L-1和77.28 mmol·L-1；NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅種子的耐鹽濃度、半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為58.09 mmol·L-1、90.64 mmol·L-1和123.19 mmol·L-1。

3 討 論

種子萌發(fā)受多種生物和非生物條件的影響，包括溫度、鹽堿、光照、水分和空氣等[33]。鹽脅迫能夠通過滲透作用延緩或阻止種子發(fā)芽[34]；通過離子毒害使植物發(fā)生營養(yǎng)失調(diào)，從而抑制種子的萌發(fā)[35]，甚至改變膜的透性，造成代謝紊亂，使植物的光合作用和呼吸作用發(fā)生變化，蛋白質(zhì)合成減少，有毒物質(zhì)在體內(nèi)積累。另外，堿性鹽和中性鹽對植物的生長有不同的影響，植物可能對不同的鹽溶液做出不同的反應(yīng)[36]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鈉鹽溶液濃度的升高，中華羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)均呈先升高后降低的趨勢，相對鹽害率在低濃度下表現(xiàn)為促進作用，即鈉鹽溶液具有高濃度抑制，低濃度促進的作用，這與紀(jì)榮花等[37]、張通穎等[38]、于崧等[39]和聶江力等[40]對芨芨草種子(Achnatherumsplendens)、豬毛蒿種子(Artemisiascoparia)、小麥種子(Triticumaestivum)和狼尾草種子(Pennisetumalopecuroides)的研究結(jié)果一致，可能是低濃度的鈉鹽溶液能夠促進細胞膜的滲透調(diào)節(jié)，也可能是微量的Na+對呼吸酶有一定的激活作用[41]，高濃度的鈉鹽抑制種子萌發(fā)可能是由于滲透脅迫和離子毒害的作用[42]。本研究表明，當(dāng)NaHCO3溶液濃度超過80 mmol·L-1，中華羊茅種子很難萌發(fā)，這與王康英[18]研究結(jié)果不一致，可能是兩種中華羊茅種子的生長環(huán)境不同，受光照、溫度、海拔等環(huán)境因素的影響，種子自身遺傳物質(zhì)以及貯存時間長短等因素的影響，種子的萌發(fā)率亦受到影響。兩種鈉鹽溶液濃度大于30 mmol·L-1時，相同濃度情況下，NaHCO3溶液脅迫下中華羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)均小于NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下的，說明NaHCO3脅迫比NaCl+NaHCO3混合脅迫具有更大的傷害力[43-44]，這可能是Na+的單鹽毒害作用，單種鹽比多種鹽類同時存在時的毒性大，同時由于離子間的相互拮抗作用，當(dāng)存在多種離子時毒害反而減少[45]。低濃度的NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫下，中華羊茅胚根的發(fā)育受到促進作用，高濃度脅迫下胚根和胚芽的生長均受到抑制，即隨溶液濃度的升高顯著下降；NaHCO3溶液脅迫下中華羊茅胚芽和胚根的生長嚴(yán)重受阻，與賈秀峰[46]和藺吉祥等[47]對苜蓿(Medicagosativa)種子和小麥種子的研究結(jié)果一致，這可能與植物細胞內(nèi)激素的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[48]。兩種鈉鹽溶液濃度相同時，NaHCO3溶液脅迫下的胚根長、胚芽長、根芽比均低于NaCl+NaHCO3混合溶液脅迫，可能是因為堿性鹽脅迫下除了Na+作用外還增加pH值的作用[49]，高pH值能夠破壞根細胞的結(jié)構(gòu)與功能，打破離子平衡，使細胞代謝紊亂，為此植物需要代謝更多的物質(zhì)與能量來抵御高pH值的傷害[47]。耐鹽半致死濃度是由低鹽到高鹽脅迫的中轉(zhuǎn)濃度，是所有耐鹽指標(biāo)由低鹽到高鹽濃度的受抑制過程中的一個“轉(zhuǎn)折點”[50]；在一定的鈉鹽濃度范圍內(nèi)，中華羊茅種子發(fā)芽率隨脅迫濃度的升高而降低，鈉鹽溶液濃度過高可完全抑制中華羊茅種子萌發(fā)，這是因為過量的Na+能夠?qū)е轮参锛毎蛎浕蜃儺?，造成胞?nèi)離子不平衡，破壞了細胞的正常生理功能[34]。

4 結(jié) 論

不同的鈉鹽脅迫對中華羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長的影響不同，適宜濃度的NaHCO3溶液和NaCl+NaHCO3混合溶液對中華羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)具有促進作用，高濃度則會抑制甚至阻止種子的萌發(fā)和幼苗的生長，說明中華羊茅種子具有一定的抗鈉鹽脅迫的能力；相同濃度條件下，NaHCO3溶液比NaCl+NaHCO3混合溶液對種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用強。