劉 青， 趙德剛,2， 趙懿琛

(1.貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院/茶學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家農(nóng)業(yè)部植物新品種DUS測(cè)試貴陽(yáng)分中心/貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽(yáng) 550006)

古茶樹(shù)(Camelliasinensis)是指生長(zhǎng)在自然林中且樹(shù)齡超過(guò)百年的野生茶樹(shù)，還包括半馴化的人工栽培型野生茶樹(shù)以及人工栽培超過(guò)百年的古茶園中的茶樹(shù)[1]。經(jīng)歷自然選擇生長(zhǎng)下來(lái)的古茶樹(shù)具有優(yōu)良的抗性基因，不需要打藥施肥，制成的茶葉綠色無(wú)污染，因此，近年對(duì)古茶樹(shù)的研究越來(lái)越受重視。目前關(guān)于古茶樹(shù)資源的研究主要集中在遺傳多樣性[2-4]、生化成分多樣性[5-6]、抗性研究[7-8]等方面。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，遺傳多樣性研究已經(jīng)不再局限于形態(tài)標(biāo)記[9-10]、細(xì)胞標(biāo)記[11]、生理生化標(biāo)記[12]等傳統(tǒng)的研究方法，基于基因組DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[13-14]、指紋圖譜構(gòu)建[15]、品種鑒定[16]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

貴州是當(dāng)今中國(guó)野生古茶樹(shù)種質(zhì)資源保存最豐富的省份之一[17]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，貴州省88個(gè)縣級(jí)行政區(qū)域中有52個(gè)縣都有古茶樹(shù)生長(zhǎng)。其中，三都水族自治縣地處云貴高原，境內(nèi)山巒疊嶂、土壤肥沃、礦質(zhì)元素和有機(jī)物質(zhì)豐富，常年云霧繚繞、無(wú)霜期長(zhǎng)、雨量充沛、年積溫可達(dá)6 600 ℃[18]，是茶樹(shù)的天然生長(zhǎng)林，茶樹(shù)資源豐富。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)由于穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、成本低、DNA模板用量少[19]等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)的遺傳多樣性研究。吳田等[20]利用12條ISSR引物對(duì)17份云南茶樹(shù)種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明遺傳相似系數(shù)介于0.50～0.88之間，聚類(lèi)結(jié)果表明17分供試材料被分為兩大類(lèi)。鄒瑞等[21]利用28條ISSR引物對(duì)15份紫鵑實(shí)生苗和親本的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16份材料共擴(kuò)出92條帶，多態(tài)性條帶比率為78.3%，多樣性指數(shù)(H)為 0.31，Shannon信息指數(shù)(I)為0.45，遺傳一致度在0.53～0.79之間；聚類(lèi)結(jié)果顯示，在0.66水平上16份供試材料被分為三類(lèi)，其中編號(hào)為SS 14的實(shí)生苗遺傳相似度與親本最高。目前，關(guān)于茶樹(shù)遺傳多樣性的研究較多，但是三都地區(qū)古茶樹(shù)的遺傳多樣性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，并且在采集樣品過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分古茶樹(shù)受到人為破壞。因此，本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州省三都縣古茶樹(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平探討古茶樹(shù)的遺傳特點(diǎn)，為當(dāng)?shù)毓挪铇?shù)資源的保護(hù)和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為貴州省三都水族自治縣145份古茶樹(shù)，詳見(jiàn)表1。

表1 用于ISSR分析的材料Table 1 Materials used for ISSR analysis

1.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

茶樹(shù)基因組DNA提取參照唐祥凱等[22]的方法進(jìn)行提取。用超微量全波長(zhǎng)讀數(shù)儀檢測(cè)DNA的濃度和純度，用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)完整性。將提取的模板DNA稀釋至20 ng·μL-1，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR體系優(yōu)化和引物篩選

選用哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR通用引物，通過(guò)對(duì)模板DNA濃度、引物濃度、MgCl2濃度、dNTP濃度、Taq酶濃度進(jìn)行梯度篩選，優(yōu)化PCR體系，利用優(yōu)化的PCR體系設(shè)置溫度梯度對(duì)引物最適退火溫度進(jìn)行篩選。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將3組重復(fù)的ISSR-PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行人工讀帶。將清晰的條帶記為1，模糊或沒(méi)有的條帶記為0，建立0，1原始矩陣。統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，其中多態(tài)性條帶比率P(%)=(多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù))×100%。用Popgene 32軟件統(tǒng)計(jì)觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)、shannon多樣性信息指數(shù)(I)、遺傳一致度。利用NTSYS pc-2.1軟件按非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR體系優(yōu)化和引物篩選

通過(guò)對(duì)酶各成分的濃度優(yōu)化后得到一個(gè)最適ISSR-PCR體系(10μL)，包括：10×PCR buffer，1μL；MgCl2，0.8μL；dNTPs；0.6μL；Taq酶，0.05μL；引物，0.5μL；DNA，1μL；ddH2O，6.05μL(圖1)。PCR擴(kuò)增體系：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，最適退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。利用優(yōu)化的PCR體系對(duì)引物進(jìn)行篩選，從100條引物中篩選得到15條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的ISSR引物(表2)，對(duì)所有模板進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 引物最佳退火溫度Table 2 Optimal annealing temperature for primers

2.2 引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

用篩選出的15條引物對(duì)供

試的145份材料(3個(gè)重復(fù))進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2～圖4)。從擴(kuò)增結(jié)果(表3)可以看出：15條引物共擴(kuò)出116條帶，平均每條引物擴(kuò)出7.73條，其中多態(tài)性條帶110條，多態(tài)性條帶比率為94.37%，不同的引物擴(kuò)出的總條帶數(shù)有差異，多態(tài)性條帶數(shù)介于4～11之間，平均每個(gè)引物檢測(cè)出的多態(tài)性位點(diǎn)為7.33條。多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)在0.68～0.86之間，引物UBC 808的多態(tài)性信息指數(shù)最低,為0.68，UBC 835的多態(tài)性信息指數(shù)最高,為0.86。無(wú)論是擴(kuò)增條帶的大小，還是擴(kuò)增條帶的多少，不同引物在同一采樣點(diǎn)古茶樹(shù)樣品的擴(kuò)增結(jié)果存在差異，同一引物在不同材料之間的擴(kuò)增結(jié)果也不同，說(shuō)明供試的古茶樹(shù)種質(zhì)資源間存在豐富的多態(tài)性。因此，利用ISSR分子標(biāo)記可以從DNA水平檢測(cè)出茶樹(shù)種質(zhì)資源間的差異。

表3 ISSR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性Table 3 Polymorphism of amplification products byISSR markers

2.3 供試古茶樹(shù)種質(zhì)資源的親緣關(guān)系分析

145份古茶樹(shù)材料經(jīng)過(guò)ISSR-PCR擴(kuò)增，用Popgene 32軟件分析各材料間遺傳一致度。結(jié)果(表4)表明，145份古茶樹(shù)材料間的遺傳相似性系數(shù)為0.448 3～0.965 5。其中喬木間的遺傳一致度為0.543 1～0.965 5，最大的是8號(hào)、9號(hào)、92號(hào)、93號(hào)喬木古茶樹(shù)，最大值為0.965 5，說(shuō)明其遺傳背景相近，遺傳相似度較高，遺傳一致度最小的是27號(hào)、101號(hào)喬木古茶樹(shù)，最小值為0.543 1，說(shuō)明其遺傳距離較遠(yuǎn)；灌木古茶樹(shù)間的遺傳一致度介于0.706 9～0.956 9之間，108號(hào)、109號(hào)、117號(hào)、118號(hào)、125號(hào)、127號(hào)的灌木古茶樹(shù)間的遺傳一致度最大，均為0.956 9，說(shuō)明其遺傳背景相似，遺傳距離較近，118號(hào)、133號(hào)灌木古茶樹(shù)的遺傳一致度最小，為0.706 9，說(shuō)明其遺傳距離較遠(yuǎn)；喬木與灌木間的遺傳距離一致度介于0.448 3～0.784 5之間，91號(hào)的喬木古茶樹(shù)和137號(hào)的灌木古茶樹(shù)間的遺傳一致度最大為0.784 5，37號(hào)的喬木古茶樹(shù)和118號(hào)的灌木古茶樹(shù)的遺傳一致度最小，為0.448 3，說(shuō)明這2株古茶樹(shù)的遺傳距離較遠(yuǎn)。由表5可知，Na為1.945 7，Ne為1.529 3，He為0.312 6，I為0.471 2。說(shuō)明145份古茶樹(shù)材料間的遺傳多樣性較為豐富。

表4 145份古茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳一致度Table 4 Genetic consistency of 145 ancient tea germplasm resources

表5 供試材料的遺傳多樣性指數(shù)Table 5 Genetic diversity index of the tested materials

2.4 不同采樣點(diǎn)古茶樹(shù)遺傳多樣性參數(shù)分析

比較不同采樣點(diǎn)樣品之間同一遺傳參數(shù)結(jié)果(表6)顯示，不同采樣點(diǎn)的古茶樹(shù)群體具有一定的差異(p<0.05)。相對(duì)于蘭懂村喬木古茶樹(shù)群體，怎雅村喬木古茶樹(shù)群體的等位基因數(shù)增加了3.6%，古奇村的灌木古茶樹(shù)群體的等位基因數(shù)降低了19.84%，蘭懂村的灌木古茶樹(shù)群體的等位基因數(shù)降低了13.52%。蘭懂村和怎雅村的喬木古茶樹(shù)群體的有效等位基因數(shù)沒(méi)有明顯差異；相對(duì)于蘭懂村古茶樹(shù)群體的Nei’s遺傳多樣性，與怎雅村喬木古茶樹(shù)群體的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)差異不大，陽(yáng)猛村喬木古茶樹(shù)群體的He值降低了14.65，古奇村灌木古茶樹(shù)群體的He值降低了48.17%，蘭懂村灌木古茶樹(shù)群體的He值降低了26.27；相對(duì)于蘭懂村喬木古茶樹(shù)I怎雅村喬木古茶樹(shù)群體的I值增加了5.0%，其他值相對(duì)于怎雅村喬木古茶樹(shù)群體的I值均較低，其中降低幅度最大的是古奇村的灌木古茶樹(shù)群體，降低了47.98%；相對(duì)于蘭懂村喬木古茶樹(shù)群體的多樣性位點(diǎn)數(shù)，除怎雅村增加了8.59%外，其他分別降低了17.09%、49.58%、33.76%，其中降低幅度最大的是古奇村的灌木古茶樹(shù)群體；相對(duì)于蘭懂村的喬木古茶樹(shù)群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)，怎雅村的喬木古茶樹(shù)群體增加了8.58%，PPB值最小的是古奇村的灌木古茶樹(shù)群體，相對(duì)于蘭懂村喬木古茶樹(shù)降低了49.57%。整體來(lái)說(shuō)喬木古茶樹(shù)的遺傳多樣性比灌木古茶樹(shù)的遺傳多樣性豐富。

表6 5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)分析Table 6 Genetic diversity analysis of 5 populations

2.5 UPGMA聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件對(duì) 145份古茶樹(shù)材料進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到相應(yīng)的UPGMA樹(shù)狀圖(圖5)，在遺傳相似性系數(shù)為0.72時(shí)，將145份供試古茶樹(shù)材料分為四大類(lèi)。第一大類(lèi)包括44份蘭懂村的喬木古茶樹(shù)；第二類(lèi)包括54份怎雅村喬木古茶樹(shù)；第三類(lèi)包含陽(yáng)猛村的9份喬木古茶樹(shù)，第四類(lèi)包括兩個(gè)亞類(lèi)，一個(gè)亞類(lèi)包括22份古奇村的灌木古茶樹(shù)，另一個(gè)亞類(lèi)包括15份蘭懂村的灌木古茶樹(shù)和1份陽(yáng)猛村的灌木古茶樹(shù)，說(shuō)明這2個(gè)地方的古茶樹(shù)遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近，聚為一類(lèi)。從聚類(lèi)結(jié)果可以看出，灌木古茶樹(shù)與喬木古茶樹(shù)的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合表型聚類(lèi)結(jié)果，并且聚類(lèi)結(jié)果與分布地域有很大的關(guān)系，基本上同一地域的古茶樹(shù)聚為一類(lèi)。表明ISSR分子標(biāo)記可用于古茶樹(shù)種質(zhì)資源的分類(lèi)鑒定及親緣關(guān)系研究。

3 討 論

本研究以三都野生古茶樹(shù)為研究對(duì)象，分析其遺傳多樣性。PCR反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)體系的每一種成分都可能對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響，濃度偏低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不充分或背景模糊，濃度過(guò)高會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此本研究對(duì)模板DNA、引物、MgCl2、dNTP、Taq酶的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。從擴(kuò)增結(jié)果看，15條引物共擴(kuò)增出116條帶，其中多態(tài)性條帶有110條，平均多態(tài)性條帶比率為94.37%，引物的多態(tài)性不僅反映了古茶樹(shù)種質(zhì)基因組的多態(tài)性，也反映了遺傳變異的差異性。從供試的145份茶樹(shù)資源分析結(jié)果來(lái)看，古茶樹(shù)材料兩兩間遺傳一致度為0.448 3～0.965 5，說(shuō)明古茶樹(shù)各株系之間的遺傳背景差異較大，遺傳多樣性較豐富。古茶樹(shù)材料的Na為1.945 7，Ne為1.529 3，He為0.312 6，I為0.471 2。前期有研究表明，貴州省26個(gè)縣的古茶樹(shù)有豐富的遺傳多樣性[2]，本研究主要分析三都水族自治縣145份古茶樹(shù)的遺傳多樣性，結(jié)果表明，該地區(qū)古茶樹(shù)的遺傳多樣性較豐富，但與前期研究結(jié)果相比偏低，說(shuō)明生長(zhǎng)在一定區(qū)域內(nèi)古茶樹(shù)比全省范圍內(nèi)古茶樹(shù)基因交流的程度低。另外，從UPGMA聚類(lèi)樹(shù)狀圖可以看出，喬木型和灌木型古茶樹(shù)能夠明顯被區(qū)分開(kāi)，并且聚類(lèi)結(jié)果與樣品生長(zhǎng)點(diǎn)密切相關(guān)，說(shuō)明該地區(qū)古茶樹(shù)基因的穩(wěn)定性和聚集性。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：首先，茶樹(shù)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的異花授粉，遺傳背景復(fù)雜[23]，且古茶樹(shù)經(jīng)歷長(zhǎng)期的自然選擇和進(jìn)化，使其產(chǎn)生一定數(shù)量的遺傳變異，通過(guò)群體內(nèi)個(gè)體間的自然雜交，其基因交流不斷豐富，從而形成了三都水族自治縣古茶樹(shù)資源豐富的遺傳多樣性。其次，該地區(qū)群山環(huán)繞、交通不便、地域的隔離阻斷了群體間的基因交流，也沒(méi)有經(jīng)過(guò)人為的良種選育，因此形成了該地區(qū)茶樹(shù)資源遺傳基因的穩(wěn)定性和聚集性。

茶樹(shù)的樹(shù)形是由喬木型向灌木型進(jìn)化的[24]。本研究4個(gè)采樣點(diǎn)的古茶樹(shù)群體的遺傳多樣性水平存在差異：怎雅村>蘭懂村1>陽(yáng)猛村>蘭懂村2>古奇村，其中前2個(gè)采樣點(diǎn)的古茶樹(shù)類(lèi)型為喬木型，陽(yáng)猛村有1株灌木型古茶樹(shù)，后2個(gè)采樣點(diǎn)的古茶樹(shù)類(lèi)型為灌木型。本研究結(jié)果表明，喬木型古茶樹(shù)的各遺傳多樣性參數(shù)均高于灌木型古茶樹(shù)，結(jié)果與張德全等[25]研究結(jié)果一致。從時(shí)間上，相比灌木，喬木為原始類(lèi)型，經(jīng)歷了更長(zhǎng)時(shí)間的自然選擇，在不斷變化的自然環(huán)境中生存下來(lái)，保留了更多的優(yōu)良基因，因此喬木的遺傳多樣性較高。從垂直分布格局上，在一定的海拔范圍內(nèi)茶樹(shù)居群的遺傳多樣性隨海拔梯度的增加呈現(xiàn)低-高-低的分布[26-27]，隨著海拔的不斷升高，環(huán)境中溫度、水分等脅迫增強(qiáng)，植株為了能夠保持穩(wěn)定生長(zhǎng)，就會(huì)通過(guò)伸長(zhǎng)枝條增加抗脅迫能力[26,28-29]，因此，喬木型古茶樹(shù)多生長(zhǎng)在海拔較高的地方，且遺傳多樣性較高。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了三都古茶樹(shù)的遺傳多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喬木型比灌木型古茶樹(shù)遺傳多樣性高，且該地區(qū)的古茶樹(shù)群體間有一定的遺傳穩(wěn)定性和聚集性，群體內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性。研究結(jié)果為該地區(qū)古茶樹(shù)的保護(hù)和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。