戎天藝，花 蕓，陳德艷，何 旻

（上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院神經內科，上海 200438）

卒中是神經科最常見的疾病，患者發(fā)病后的神經功能缺失癥狀在起病2～3 d 內呈漸進性加重，稱為早期神經功能惡化 （early neurological deterioration,END）[1]，其發(fā)生率高達13.0%～37.5%[2-3]，常導致嚴重的神經功能缺損和殘疾，并增加了病死率。目前，END 的病因和發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)病機制可能與炎性反應[4]、血栓進展[5]、腦水腫[6-7]、出血轉化[8]、癲癇發(fā)作[9]等有關。

眾所周知，大動脈粥樣硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）性狹窄是導致卒中發(fā)生的主要原因[10]，且在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中，炎癥因子發(fā)揮著重要作用[11]。既往研究較多關注基質金屬蛋白酶、白細胞介素、腫瘤壞死因子等。有研究提示，天冬酰胺內肽酶（legumain，LGMN）在炎性反應過程中起抗原呈遞作用。LGMN 是近年發(fā)現(xiàn)的一類新型半胱氨酸蛋白酶，其作為一種應激反應蛋白，只在特定條件下表達。LGMN 在哺乳類動物體內具有抗細胞凋亡作用，在炎癥反應過程中起抗原呈遞作用，能夠抑制骨質鈣化，同時其在轉移或浸潤的腫瘤相關巨噬細胞內高度表達[12]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊（尤其是在不穩(wěn)定斑塊）中LGMN 的水平上調，且其水平與頸動脈及主動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關[13-14]?？梢?，LGMN水平與END 風險間是否相關，值得研究。本研究就急性LAA 型卒中患者的LGMN 水平與END 間的關系進行研究，以期為臨床早期識別END 提供參考。

資料與方法

一、資料

本研究連續(xù)納入2016 年1 月1 日至2018 年12 月31 日間上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院神經內科病房收治的卒中患者，納入標準為滿足如下所有條件。①起病時間在72 h 內；②年齡大于18 歲；③符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[15]，經頭顱CT 或頭顱MRI 檢查證實為卒中，發(fā)病前無明顯肢體殘疾，且改良Rankin 量表 （modified Rankin Scale,mRS）評分≤1 分；④有頸內動脈系統(tǒng)和（或）椎-基底動脈系統(tǒng)癥狀和體征；⑤TOAST （Trial of ORG 10 172 in Acute Stroke Treatment） 分型[16]為LAA 型；⑥經頭頸部CT 血管成像（CT angiography,CTA）檢查證實腦動脈狹窄>50%。END 評定標準為入院3 d 內任意時間點復評美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分較入院時增加≥2 分[16]。同時，排除具有以下任一情況者。①TOAST 分型為其他類型的卒中；②合并其他系統(tǒng)的嚴重疾病，如急性冠脈綜合征、惡性腫瘤、全身感染性疾病、自身免疫病、嚴重肝和（或）腎功能障礙等；③近期應用抗凝藥物、靜脈溶栓或血管內治療的患者；④正在服用免疫抑制劑或激素；⑤處于孕期或哺乳期。具體流程見圖1，最終有334 例LAA 型卒中患者被納入本研究。

圖1 研究對象納入和排除流程圖

本研究獲得上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院臨床倫理委員會批準。所有患者或家屬均已簽署知情同意書。

二、方法

1.基線資料收集：收集所有研究對象的人口統(tǒng)計學信息（年齡、性別）、卒中危險因素（高血壓、糖尿病、高血脂、心房顫動、身高、體重、吸煙、飲酒）、基線血壓以及血液檢查結果 （包括超敏C 反應蛋白、空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇，國際標準化比值、D-二聚體）。所有患者均行頸動脈超聲檢查，根據超聲特征將斑塊分為穩(wěn)定斑塊（強回聲鈣化斑塊）和易損斑塊（低回聲、等回聲及混合回聲斑塊）。

2.血清學檢查：所有患者均于入院次日清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，行3 000 r/min 離心15 min（離心半徑為10 cm），分離血清后置于-80 ℃冰箱內保存。所有血標本均無溶血。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測定LGMN（μg/L）水平。人LGMN ELISA 試劑盒購自美國RayBiotech公司。

3.影像學檢查：根據患者的頭顱MRI 或頭顱CT 的影像學特征，結合臨床表現(xiàn)，明確此次發(fā)病的責任病灶。前循環(huán)梗死病灶位于頸內動脈、大腦中動脈或大腦前動脈供血區(qū)，后循環(huán)梗死病灶位于基底動脈、椎動脈或大腦后動脈供血區(qū)。采用頭頸部CTA 檢查對腦血管進行評價。腦血管的狹窄率范圍在50%～70%為中度狹窄；狹窄率范圍在70%～99%（不包括70%）為重度狹窄；狹窄率＞99%為閉塞。采用頭顱MRI 檢查以及血管評估來判斷患者的TOAST 分型是否為LAA。

4.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件完成數據分析。所有數據均Kolmogorov-Smirnov 檢驗，正態(tài)分布計量資料以±s 表示，2 組間采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗。非正態(tài)分布連續(xù)變量采用中位數（四分位數）[M（IQR）]表示，2 組間采用Mann-Whitney U 檢驗；多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料以頻數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多變量Logistic 回歸分析確定END 的獨立危險因素，采用受試者操作特征（receiver operator characteristic,ROC）曲線進一步研究血清LGMN 對END 的預測價值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、基線資料

本研究的334 例急性LAA 型卒中患者中，有78 例（23.4%）發(fā)生END（作為END 組），平均年齡為（72.8±9.7）歲，其中有69.2%的梗死病灶位于前循環(huán)。另256 例入院3 d 內未發(fā)生END 的患者作為非END 組。在人口統(tǒng)計學特征方面，2 組間的年齡、性別相仿（P>0.05）（見表1）。在血管危險因素方面，END 組患者合并高血壓、糖尿病、高血脂、存在易損斑塊的比例較非END 組高（P 均<0.01）。在臨床特征方面，END 組患者的入院收縮壓、入院卒中癥狀嚴重程度（入院NIHSS 評分）以及血清LGMN、空腹血糖、糖化血紅蛋白、超敏C 反應蛋白水平均顯著高于非END 組，差異有統(tǒng)計學意義 （P 均<0.05）（見表1）。

二、影響END 因素的多因素Logistic 回歸分析

以表1 中P<0.1 的變量作為自變量，納入分類變量（高血壓、糖尿病、高血脂、易損斑塊及顱內血管狹窄程度），連續(xù)變量（入院收縮壓、LGMN、空腹血糖、糖化血紅蛋白及入院NIHSS 評分），以是否發(fā)生END 作為因變量，進行非條件二分類Logistic 回歸分析顯示，血清LGMN 水平升高[優(yōu)勢比（odds ratio，OR）=1.309，95%置信區(qū)間 （confidence interval，CI）為1.188～1.441，P<0.001]是發(fā)生END 的獨立危險因素。其他危險因素還包括易損斑塊存在及入院收縮壓水平、糖化血紅蛋白水平、入院NIHSS 評分（見表2）。

表2 影響END 發(fā)生因素的Logistic 回歸分析

表1 END 組與非END 組資料比較

三、血清LGMN 預測LAA 型卒中患者發(fā)生END 的ROC 曲線分析

ROC 曲線分析結果顯示，血清LGMN 預測END 的曲線下面積為0.715（95%CI 為0.663～0.763，P＜0.001），此時最佳臨界值為6.73 μg/L，預測END的靈敏度為64.1%，特異度為81.3%，陽性預測值為51.0%，陰性預測值為88.1%（見圖2）。

圖2 血清LGMN 預測LAA 型卒中患者發(fā)生END 的ROC 曲線

四、END 組顱內血管不同程度狹窄組實驗室指標比較

在END 患者中，中度狹窄組及閉塞組的血清LGMN 水平顯著低于重度狹窄組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.04）（見表3）。3 組患者的空腹血糖、超敏C反應蛋白、D-二聚體、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、糖化血紅蛋白水平以及國際標準化比值差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 END 組顱內血管不同程度狹窄組的實驗室指標比較

討 論

LGMN 是一類新型半胱氨酸蛋白酶，作為一種應激反應蛋白，其在特定條件下表達，并可影響細胞外基質重塑從而影響粥樣硬化病變的進展及斑塊的穩(wěn)定性。LGMN 可激活其他蛋白酶，如基質金屬蛋白酶2、組織蛋白酶L 和纖連蛋白[17-19]。既往幾項研究報道了LGMN mRNA 和蛋白在頸動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定區(qū)域中的表達上調，提示LGMN 在不穩(wěn)定斑塊中的作用[12,14,20]。Umei 等[21]研究報道了伴有復雜冠狀動脈病變的冠心病患者血漿LGNM 水平明顯高于無復雜病變的冠心病患者以及無冠心病者。血漿高LGMN 水平是復雜冠狀動脈病變相關的獨立危險因素。在挪威的一項研究中，頸動脈狹窄的患者血漿LGMN 水平明顯高于健康對照組，但頸動脈狹窄程度與LGMN 的水平無相關性[22]。

在本研究中，END 組卒中患者的血清LGMN水平高于非END 組，提示LGMN 是預測END 的獨立危險因素。調整高血壓、糖尿病等混雜因素后，血清LGMN 水平升高仍是END 發(fā)生的獨立危險因素。進一步進行ROC 曲線分析，結果顯示，LGMN預測END 的曲線下面積為0.715，此時最佳臨界值為6.73 μg/L，靈敏度為64.1%，特異度為81.3%，提示LGMN 對LAA 型卒中患者發(fā)生END 有一定預測價值，聯(lián)合其他指標如超敏C 反應蛋白可能有更高的預測價值。故在今后的臨床工作中，可考慮檢測LAA 型卒中患者的血LGMN 水平以助于早期發(fā)現(xiàn)易發(fā)生END 的人群，從而進行早期干預，改善患者的預后。筆者推測，高LGMN 水平可引起動脈粥樣硬化斑塊內炎癥加重，使其不穩(wěn)定而更易破裂，這可能是LAA 型急性缺血性卒中患者發(fā)生END 的機制之一。另外本研究結果顯示，顱內血管重度狹窄患者的血清LGNM 水平明顯高于中度狹窄及閉塞患者，這可能與斑塊不穩(wěn)定有關。

本研究有如下不足。首先，他汀類藥物可能對血漿LGMN 水平有影響。Wang 等[23]報道了經過12 周阿托伐他汀治療40 例冠心病患者，其單核細胞中LGMN mRNA 的表達下降。本研究中，有20.4%的患者在發(fā)病前服用了他汀類藥物，因而本研究的結果可能存在干擾。其次，本研究未評估血清LGMN 活性形式，LGMN 合成分子相對分子質量為56 000，而其激活需要裂解成相對分子質量為36 000 的活性形式[24]。由于，目前還沒有ELISA 試劑盒可以檢測LGMN 的活性形式，本研究使用ELISA試劑盒測量的是其前體和活性形式的總水平。最后本研究為單中心回顧性研究，具有地域局限及病例選擇缺乏代表性，且僅納入了334 例患者，樣本量較小，可能對結果有影響。最后，本研究僅分析了TOAST 亞型為LAA 型的急性缺血性卒中患者，今后可擴大樣本，進一步研究血LGMN 水平與其他亞型急性缺血性卒中患者發(fā)生END 間的關系。

總之，急性LAA 型卒中患者的血LGMN 水平與END 發(fā)生密切相關，可能成為預測END 的新型生物標志物。