鄒 玲，孔垂民，殷 茵，劉煥奇，劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

摩氏摩根菌為兼性厭氧的革蘭陰性桿菌，能夠誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶，對多種抗生素具有抗性。該菌廣泛存在于自然界、人及多種動物的胃腸道中，為條件致病菌，可引起人獸感染[1]。1980年在人膝關(guān)節(jié)炎病例中首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌[2]，對于其引起感染的報道主要集中在人的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心包炎和眼內(nèi)膜炎等炎癥病例中[3]，關(guān)于動物感染的報道較少。近來在水產(chǎn)動物研究中有摩氏摩根菌感染的報道[4-5]。Zhao等首次報道雞感染摩氏摩根菌引起群體死亡[6]。但未見有關(guān)于實驗動物大范圍感染摩氏摩根菌的報道。BALB/c小鼠為近交系小鼠，具有遺傳基因純、個體差異小等特點，是生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常選用的實驗動物。本試驗對2018年11月某實驗動物養(yǎng)殖場送檢的一批消瘦、被毛粗亂的BALB/c小鼠進行了實驗室檢測，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及主要試劑 某實驗動物養(yǎng)殖場送檢的疑似患病BALB/c小鼠10只、健康的BALB/c小鼠20只。PCR試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 送檢BALB/c小鼠的臨床診斷 對送檢的BALB/c小鼠進行斷頸處死，經(jīng)浸泡消毒后進行剖檢。

1.3 細菌的分離與鏡檢 無菌操作對剖檢發(fā)現(xiàn)有明顯病變的肝臟及腸系膜淋巴結(jié)進行細菌的分離，接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基及SS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，取單菌落進行三代純化。挑取純化好的單菌落進行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.4 細菌的16S rRNA基因測序及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中搖菌12 h作為PCR反應(yīng)的模板，利用16S rRNA基因的通用引物27F和907R進行PCR擴增，預(yù)期目的條帶為900 bp。反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 12 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min； 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，將與目的條帶一致的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果利用NCBI的Blast進行比對，從GenBank中下載同源性較高序列，利用MEGA 7.0中的最大簡約法制作進化樹，進行遺傳進化關(guān)系分析。

1.5 動物回歸試驗 以109CFU/mL的分離菌菌液分別經(jīng)腹腔注射和灌胃途徑各攻毒5只健康BALB/c小鼠，每只0.2 mL，同時設(shè)生理鹽水對照組，相同條件下進行隔離飼養(yǎng)觀察。

1.6 藥敏試驗 為了篩選敏感藥物以對疾病進行有效控制，采用常規(guī)的藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗，根據(jù)《歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)》判定細菌對藥物的敏感性，選擇敏感藥物進行治療。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理變化 剖檢病變小鼠可見，小鼠的肝臟腫大，表面遍布出血點(中插彩版圖1A)，腸系膜淋巴結(jié)顯著腫大、瘀血，腸道可見出血點(中插彩版圖1B)。 脾臟淤血呈暗紅色(中插彩版圖1C)。

圖1 患病小鼠剖檢器官病變A: 肝臟腫大、出血; B: 腸系膜淋巴結(jié)腫大、淤血; C: 脾臟呈暗紅色

2.2 細菌的分離與鏡檢 無菌操作對發(fā)病鼠進行細菌分離。經(jīng)24 h培養(yǎng)，在普通營養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂中均有菌落長出，普通營養(yǎng)瓊脂上菌落呈灰白色、不透明，在光照下有淡綠色光澤。在SS平板上為無色、透明、圓形菌落。純化細菌經(jīng)染色鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭陰性小桿菌。

2.3 細菌的16S rRNA基因測序及系統(tǒng)進化樹分析 使用16S rRNA基因的通用引物進行菌液PCR擴增，結(jié)果得到了預(yù)期900 bp左右的單一目的條帶(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)比對，顯示分離菌株與摩氏摩根菌(序列號為JX049341.1)有99%同源性，可確認(rèn)分離細菌為摩氏摩根菌。

圖2 PCR電泳檢測結(jié)果M：DL2 000 marker； 1：陰性對照； 2：臨床分離株

在GenBank下載與分離菌株同源性較高的基因序列，利用MEGA 7.0制作進化樹，進行遺傳進化關(guān)系分析。由圖3可知，本試驗分離菌株與在大鯢分離到的基因號為JX049341.1的摩氏摩根菌同源性最高，可達66%。

圖3 分離菌的16S rRNA系統(tǒng)進化樹注：框內(nèi)為本試驗分離菌株

2.4 攻毒試驗 腹腔注射組小鼠于攻毒17 h后全部死亡，剖檢可見攻毒小鼠肝臟、脾臟嚴(yán)重出血、淤血，腸系膜腫大、出血，與臨床發(fā)病小鼠癥狀一致。灌胃組小鼠于攻毒18 h后開始出現(xiàn)精神沉郁現(xiàn)象，28 h全部死亡，剖檢癥狀同上。對照組小鼠健康存活。綜合細菌鑒定和攻毒試驗結(jié)果，確診此次疫情由摩氏摩根菌引起。

2.5 藥敏試驗 紙片擴散法藥敏試驗結(jié)果見表1。由表1可知，分離菌株的耐藥率達75%，僅對新霉素、鏈霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考敏感。

表1 分離菌株的藥敏試驗

2.6 治療效果 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，同時考慮藥物間的協(xié)同作用和藥物代謝途徑等因素，選擇新霉素和氟苯尼考進行聯(lián)合用藥，同時加強了通風(fēng)換氣和環(huán)境消毒，結(jié)果大群在用藥2 d即表現(xiàn)出明顯好轉(zhuǎn)，連續(xù)用藥5 d完全控制了病情，鼠群恢復(fù)了健康。

3 討論

根據(jù)養(yǎng)殖場中BALB/c小鼠的發(fā)病情況及臨床剖檢癥狀，初步判定該養(yǎng)殖場存在傳染性疾病，通過細菌的分離鑒定及動物回歸試驗，確診了疫情是由摩氏摩根菌引起。摩氏摩根菌是一種人獸共患病病原菌，該菌主要引起多種炎癥反應(yīng)及實質(zhì)器官充血、出血[7]。根據(jù)剖檢癥狀可知，本試驗分離到的摩氏摩根菌主要侵害小鼠的肝臟、脾臟及腸道等臟器。

動物回歸試驗結(jié)果表明，通過腹腔注射及灌胃2種攻毒途徑均可引起小鼠死亡，腹腔注射組攻毒13 h即出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，剖檢顯示內(nèi)臟器官出血、充血現(xiàn)象明顯，說明分離的菌株毒力很強，灌胃組的剖檢與臨床發(fā)病小鼠癥狀基本一致，說明該菌很可能經(jīng)消化道途徑感染。16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明，本試驗分離菌株與2012年在四川成都的患病大鯢體內(nèi)分離的基因號為JX049341.1的摩氏摩根菌在同一分支，進一步說明該菌分布廣泛，致病力強。

選用針對革蘭陰性菌的16種藥物進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，分離菌株耐藥性很強，僅對新霉素、氟苯尼考等4種藥物敏感。摩氏摩根菌能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶，對β-內(nèi)酰胺類藥物具有一定的抗性[8]，但有報道表明摩氏摩根菌對部分頭孢類藥物敏感[9]，這可能與不同菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的種類活性不同有關(guān)。新霉素內(nèi)服很少吸收，便于對腸道病原菌產(chǎn)生殺菌作用；氟苯尼考吸收快，分布廣，能夠較長時間維持有效血藥濃度，利于殺滅侵入內(nèi)臟器官的細菌，2種藥物聯(lián)合使用有利于對疾病及時有效控制。

摩氏摩根菌作為機會致病菌只有在宿主抵抗力降低的條件下才會引起發(fā)病，BALB/c小鼠作為近交系小鼠遠比不上昆明系等實驗鼠對外界不良環(huán)境的抵抗力強，其發(fā)病與養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)。經(jīng)了解該養(yǎng)殖場BALB/c小鼠養(yǎng)殖車間存在養(yǎng)殖密度大，通風(fēng)不良導(dǎo)致氨味濃重以及消毒不徹底等問題，這些因素會導(dǎo)致小鼠抵抗力下降，從而增加病原易感性，所以實驗動物養(yǎng)殖場要遵循動物福利基本要求，首先為實驗動物提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境，保持適宜的溫度、濕度和合理的飼養(yǎng)密度，加強通風(fēng)換氣和環(huán)境消毒頻率，確保墊料衛(wèi)生并及時更換，重視飼料營養(yǎng)水平，提高機體免疫力，從而降低患病機率。