于泓瀟，李思鴻，肖天石，張藝馨，楊雨齊，李佳瑞，楊洪亮，張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

德拉昔布屬于非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物，化學(xué)名為4-[5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-二氟甲基-1H-咪唑-1-基]苯磺酰胺，分子式為C17H14F3N3O3S，分子量為397.38，是環(huán)氧酶-2選擇性抑制劑中的一員，也是第1款被美國(guó)食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于犬的環(huán)氧酶-2選擇性抑制劑[1]，臨床上用于治療犬的骨關(guān)節(jié)炎癥及疼痛，并可預(yù)防犬牙科與骨科手術(shù)后的疼痛[2]。德拉昔布對(duì)環(huán)氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)具有高度的選擇性抑制作用，從而阻斷下游致炎、致痛性前列腺素合成[3]，產(chǎn)生抗炎和鎮(zhèn)痛作用，而對(duì)環(huán)氧酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)抑制作用較小，因此對(duì)COX-1的正常生理性功能影響較小[4]。相比于其他非選擇性環(huán)氧酶抑制劑，即傳統(tǒng)非甾體抗炎藥物(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，德拉昔布對(duì)消化系統(tǒng)的損害(如潰瘍、出血、黏膜損傷)明顯減輕[5-6]。因其抗炎、鎮(zhèn)痛效果好，胃腸道副作用小等優(yōu)勢(shì)，在治療犬骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的疼痛等方面，德拉昔布已逐漸替代其他非選擇性環(huán)氧酶抑制劑，成為美國(guó)獸醫(yī)臨床治療的主流選擇[7]。

目前，德拉昔布咀嚼片(Deracoxib chewable tablets)尚未在中國(guó)大陸上市，對(duì)其含量測(cè)定方法也未見報(bào)道。本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)德拉昔布咀嚼片含量的方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的德拉昔布咀嚼片與美國(guó)已經(jīng)上市的Deramaxx咀嚼片進(jìn)行含量檢測(cè)，為德拉昔布咀嚼片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)[8-9]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 德拉昔布咀嚼片(實(shí)驗(yàn)室自制，規(guī)格25 mg，批號(hào)：20180507、20180514、20180521)；德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品(北京Absin公司，CAS號(hào)：169590-41-4，純度 99%)；Deramaxx(美國(guó)Novartis公司，規(guī)格：25 mg，批號(hào)：175227C)；乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；甲醇(色譜純，山東禹王和天下材料有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，西隴科學(xué)有限公司)。

1.2 主要儀器 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Waters 2998 紫外檢測(cè)器(美國(guó) Waters公司)；AL 204 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司)；KQ-100E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；PB-10酸度計(jì)(德國(guó)Sartorius公司)。

1.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Wasters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH=4.5)∶乙腈 (52∶48，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm； 流速1 mL/min；柱溫30 ℃。

1.4 溶液配制

1.4.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取2.5 mg德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品，1 mL甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶制成含德拉昔布0.01 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品貯備液。

1.4.2 供試品溶液配制 分別取標(biāo)示量為25 mg德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，充分研碎，加入適量甲醇定容至250 mL容量瓶中作為供試品儲(chǔ)備液，超聲處理20 min，取2 mL供試品貯備液以3 000 r/min離心10 min，精密吸取上清1 mL供試品儲(chǔ)備液定容至25 mL容量瓶中，作為供試品。

1.5 專屬性 按德拉昔布咀嚼片處方壓出空片(不含主藥德拉昔布，使用等量淀粉替代)，按1.4.2方法制成空白輔料溶液，另分別取標(biāo)示量25 mg的德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，同樣按1.4.2方法處理，樣品經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)后，取上述溶液各10 μL， 注入HPLC，記錄色譜圖與峰面積。

1.6 HPLC測(cè)定的方法學(xué)研究[10]

1.6.1 線性關(guān)系 精密稱定德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，按1.4.1方法操作，稀釋成0.01 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取0.5、1、2、4 mL和8 mL儲(chǔ)備液，以甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成含量分別為0.5、1、2、4 μg/mL和8 μg/mL一系列濃度的德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)作圖并進(jìn)行回歸分析，應(yīng)用SPSS 22.0建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6.2 儀器精密度 按1.4.1方法制成對(duì)照品貯備液，取對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液4 mL定容到10 mL容量瓶中，配成含量為4 μg/mL的德拉昔布，取10 μL注入HPLC，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖與峰面積。

1.6.3 重復(fù)性 日內(nèi)重復(fù)性：按1.4.2方法分別平行配置供試品5份，各取10 μL在同天進(jìn)樣，記錄色譜圖與峰面積。日間重復(fù)性：按1.4.2方法分別在5 d內(nèi)每天配制供試品一份，每次進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

1.6.4 靈敏度 按1.4.1方法配制對(duì)照品貯備液，逐步稀釋進(jìn)行檢測(cè)，以Empower 2軟件建立的處理方法計(jì)算信噪比，依據(jù)信噪比在3左右時(shí)，確定檢測(cè)限(Limit of detection，LOD)，依據(jù)信噪比在10左右時(shí)，確定定量限(Limit of quantification，LOQ)。

1.6.5 溶液穩(wěn)定性 按1.4.1方法配置好對(duì)照品，分別在0、2、4、8、16 h和24 h測(cè)定對(duì)照品的含量變化，評(píng)價(jià)德拉昔布在甲醇溶劑中的穩(wěn)定性。

1.6.6 回收率 采用加樣回收率測(cè)定法，精密稱定德拉昔布咀嚼片適量，按1.4.2方法平行配制供試品3份，分別按已知對(duì)照品含量的80%、100%和120%精密添加德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品，各取10 μL注入HPLC，重復(fù)3次上述操作，記錄色譜圖與峰面積。

1.7 耐用性[11]將方法的流動(dòng)相比例，磷酸鹽緩沖液pH，流速與柱溫進(jìn)行微小改變，考察細(xì)微的色譜條件變化對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，精密稱定已知含量的德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品，按1.4.1方法配制，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

1.8 含量測(cè)定 選取不同批次的德拉昔布咀嚼片與Deramaxx，按1.4.2方法配制供試品，以建立的德拉昔布咀嚼片含量測(cè)定法測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 專屬性結(jié)果如圖1～3所示，德拉昔布保留時(shí)間約為10.9 min，空白輔料不會(huì)對(duì)主藥德拉昔布峰產(chǎn)生干擾，表明該方法的專屬性良好。

圖1 空白輔料液相色譜圖Fig.1 The liquid chromatogram of blank excipients

圖2 德拉昔布咀嚼片液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of deracoxib chewable tablets

圖3 Deramaxx液相色譜圖Fig.3 The liquid chromatogram of Deramaxx

2.2 HPLC測(cè)定的方法學(xué)研究 結(jié)果見表1。經(jīng)SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)得到樣品濃度C(Concentration)與峰面積A(Peak area)的回歸方程A=31 577C+3 514.7 (r2=0.999 2)，經(jīng)回歸分析得到Sig<0.01，峰面積與濃度顯著相關(guān)，說(shuō)明在0.5～8 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，德拉昔布的濃度與峰面積顯著相關(guān)，且相關(guān)性良好。建立的HPLC法檢測(cè)德拉昔布的檢測(cè)限與定量限分別為0.051 μg/mL和0.16 μg/mL；方法的平均回收率為(99.68±0.53)%，符合回收率規(guī)定在98%～102%，RSD<2%；日內(nèi)與日間重復(fù)性分別為0.94%和1.85%，均<2%，符合有關(guān)規(guī)定；儀器精密度結(jié)果為0.56%<2%，表明儀器精密度良好，其結(jié)果可信；溶液穩(wěn)定性結(jié)果為0.57%<2%，表明德拉昔布24 h以內(nèi)在甲醇溶劑中穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)以上方法學(xué)考察，證明該檢測(cè)方法可行。

表1 HPLC法檢測(cè)德拉昔布咀嚼片的方法學(xué)考察Table 1 The validation of HPLC for the determination of deracoxib chewable tablets

2.3 耐用性 結(jié)果見表2。經(jīng)細(xì)微改變流動(dòng)相比例，磷酸鹽緩沖液pH，流速與柱溫，考察對(duì)含量測(cè)定的影響。不同條件下，其含量結(jié)果的RSD為0.82%，說(shuō)明細(xì)微的條件改變對(duì)含量結(jié)果基本無(wú)影響，方法耐用性良好。

表2 HPLC法檢測(cè)德拉昔布咀嚼片的條件耐用性Table 2 Robustness of the HPLC method for determination of deracoxib chewable tablets

2.4 3批樣品的含量測(cè)定 含量測(cè)定結(jié)果見表3。3批樣品的含量均在90%～110%，符合獸藥典關(guān)于片劑含量的要求。

表3 不同批次的德拉昔布咀嚼片含量Table 3 Content of deracoxib chewable tablets in different batches

3 討論

關(guān)于波長(zhǎng)選擇，對(duì)德拉昔布進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)252 nm處，吸收值較大，有關(guān)物質(zhì)也有一定吸收，但輔料在此波長(zhǎng)下無(wú)吸收。從而確定在252 nm處測(cè)定德拉昔布的含量。

關(guān)于溶劑的選擇，因?yàn)榈吕舨茧y溶于水，易溶于DMSO，可溶于甲醇、乙腈，所以分別對(duì)3種溶劑進(jìn)行考察，3種溶劑對(duì)于有關(guān)物質(zhì)以及含量影響不大，所以最終選擇價(jià)格比乙腈、DMSO便宜的甲醇作為溶劑。

關(guān)于流動(dòng)相的選擇，最開始使用水與乙腈作為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)適當(dāng)比例調(diào)整后，發(fā)現(xiàn)峰型不理想，于是把水換成不同pH磷酸鹽緩沖液進(jìn)行考察[12]，發(fā)現(xiàn)pH為4.5時(shí)，德拉昔布主峰的峰型最好，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)谋壤{(diào)整，最終確定流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH=4.5)∶乙腈(52∶48，v/v)。

樣品的溶解超聲時(shí)間確定，德拉昔布咀嚼片被粉碎后，用甲醇溶解，超聲粉碎處理。為考察超聲時(shí)間的影響，分別超聲10、20 min和30 min考察對(duì)含量測(cè)定的影響[13]，在既保證德拉昔布完全從輔料中釋放溶解，又保證工作效率的前提下，超聲時(shí)間最終定為20 min。

德拉昔布作為一款還未在我國(guó)上市的犬類專用環(huán)氧酶抑制劑，建立穩(wěn)定、有效的含量測(cè)定方法對(duì)于今后德拉昔布質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定可以提供理論依據(jù)。所建立的方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，符合相關(guān)要求，可用于德拉昔布咀嚼片的含量測(cè)定。