黃 立，唐明甜，肖百全，顏 青，李 月，劉忠華，饒軍華

(1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所 廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室 ， 廣東 廣州 510260 ； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣東 廣州 510642 ； 3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣東 廣州 510280)

心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)嚴(yán)重威脅人類的健康，《2017年中國心血管病報告》顯示，因CVD死亡的人數(shù)已占據(jù)我國居民疾病死亡的40%以上[1]，2005—2015年因CVD造成的直接經(jīng)濟(jì)損失更是達(dá)到5 500億美元以上[2]。CVD的主要危險因素有動脈粥樣硬化、冠心病和中風(fēng)等，而這些危險因素都與高膽固醇血癥密不可分，流行病學(xué)研究結(jié)果也表明，總膽固醇與CVD的發(fā)病呈正相關(guān)，降低血清膽固醇水平可顯著降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險。目前，臨床上用于降低膽固醇的藥物主要有他汀類、膽汁酸螯合劑、煙酸類等。這些藥物在防治高脂血癥相關(guān)疾病中發(fā)揮著非常重要的作用。然而這些藥物也存在一些不足，如長期服用會出現(xiàn)肌肉疼痛、橫紋肌溶解等不良反應(yīng)[3]。相對于化學(xué)藥而言，中藥不良反應(yīng)較少，并且毒副作用低，但中藥也存在一些限制其發(fā)展的因素，如藥效作用與化學(xué)藥相比較低，有效成份復(fù)雜，作用機(jī)制不明確等。除了使用降膽固醇藥之外，近年來有研究報道益生菌也具有降低膽固醇的作用，這給CVD及其相關(guān)疾病的防治提供了一條新的思路。益生菌作為體內(nèi)固有的一種微生物，具有高效、低毒、易批量制備等優(yōu)點(diǎn)，將來可能替代傳統(tǒng)藥物或作為傳統(tǒng)藥物強(qiáng)有力的補(bǔ)充。本文對近年來益生菌降膽固醇的作用及機(jī)制研究進(jìn)行綜述，為降膽固醇類益生菌的研發(fā)提供參考。

1 益生菌降膽固醇作用

益生菌(Probiotics)，已被世界糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為“活”的微生物，最近有學(xué)者提出“下一代益生菌”(Next generation probiotics，NGP)的概念，將NGP定義為“活體生物治療藥品”(Living biological pharmaceuticals，LBP)[4]。自1974年Mann[5]首次報道乳酸菌具有降低血清膽固醇水平的作用起，已發(fā)現(xiàn)多種可降膽固醇的益生菌，如乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、腸球菌等。大量體外試驗(yàn)、動物模型試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)表明，益生菌具有顯著降膽固醇作用(表1)。

表1 具有降膽固醇作用益生菌

1.1 體外試驗(yàn) 體外試驗(yàn)是考察益生菌是否具有降低膽固醇作用的常用方法，通過體外試驗(yàn)?zāi)茉诙虝r間內(nèi)驗(yàn)證益生菌是否具備降膽固醇的作用，并從大量菌株中篩選出降膽固醇作用最明顯的菌株。李雅迪等[6]從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選出1株乳桿菌S11，進(jìn)行體外降膽固醇篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其膽固醇降低率可高達(dá)75.64%，并具有一定的耐酸和耐膽鹽能力。黃燕燕等[18]也通過體外試驗(yàn)方式從開菲爾粒和陳年泡菜水中篩選出1株乳桿菌DMDL9010，其膽固醇降解率達(dá)37.58%。

1.2 動物模型 目前，用于研究高膽固醇血癥模型的動物有斑馬魚、大/小鼠、兔、豬、猴等。Fei等[8]在高膽固醇血癥斑馬魚飲食中分別添加乳桿菌LAB4和LAB12后，發(fā)現(xiàn)斑馬魚血清總膽固醇(Total cholesterol，TC)分別降低了64%和71%。El-Gawad等[12]用雙歧桿菌Bb-46發(fā)酵酸奶喂養(yǎng)高膽固醇血癥大鼠35 d后，血清TC和低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)分別下降了50.3%和56.3%。Zhu等[15]用腸球菌ATCC19433灌胃高膽固醇血癥小鼠，4周后發(fā)現(xiàn)小鼠血清及肝臟膽固醇濃度顯著降低。

1.3 臨床試驗(yàn) 經(jīng)過人類長期食用并證實(shí)安全可靠的降膽固醇益生菌主要包括乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的菌株。臨床研究通常將單菌株或混合菌株包裹在膠囊內(nèi)或制成發(fā)酵酸乳的形式給予受試人群評估其降膽固醇效果。Costabile等[9]將植物乳桿菌ECGC13110402制成膠囊進(jìn)行臨床試驗(yàn)，6周后發(fā)現(xiàn)受試者血清TC下降了2.3%～36.7%。Nakamura等[10]連續(xù)12周給受試者飲用含乳桿菌CP1563的測試飲料，發(fā)現(xiàn)受試者TC和LDL-C均顯著降低(P<0.001)。

2 益生菌降膽固醇機(jī)制

體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)主要由肝臟和腸道調(diào)節(jié)，研究表明，益生菌可作用于肝臟和腸道降低膽固醇，但其作用機(jī)制尚不明確。目前，益生菌降低膽固醇的大多數(shù)假設(shè)都是基于體外及動物試驗(yàn)，很少有基于臨床試驗(yàn)來研究益生菌降膽固醇的機(jī)制?，F(xiàn)主要有如下假設(shè)。

2.1 改變腸道菌群結(jié)構(gòu) 腸道菌群與宿主的脂代謝有密切關(guān)系，研究表明，腸道菌群失衡與血清脂質(zhì)水平具有顯著相關(guān)性。益生菌可選擇性地刺激胃腸道中有益微生物的生長，通過調(diào)節(jié)腸道菌群生態(tài)平衡降低膽固醇，Soyoung等[7]發(fā)現(xiàn)，乳桿菌BFE5264能調(diào)節(jié)高膽固醇飲食小鼠腸道菌群的紊亂，降低螺旋桿菌科和脫硫弧菌科的數(shù)量，增加乳酸菌屬的豐度。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)，用腸球菌ATCC19433灌胃高膽固醇血癥小鼠后，其腸道乳酸菌、雙歧桿菌和Akkermansia數(shù)量也明顯增加。

2.2 抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性 生物體在肝臟以乙酰輔酶A為原料最終合成膽固醇，其中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶是此過程的限速酶，抑制HMG-CoA還原酶活性可有效降低體內(nèi)膽固醇水平。黃燕燕等[18]用植物乳桿菌DMDL9010灌胃大鼠70 d，高脂組大鼠血清TC和LDL-C分別下降了23.03%和28.00%，并發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中HMG-CoA還原酶基因mRNA的相對表達(dá)量下調(diào)了62.86%，表明其降膽固醇機(jī)制可能是影響HMG-CoA還原酶的活性。Kumar等[19]研究發(fā)現(xiàn)，灌胃鼠李糖乳桿菌(LGG)后，高脂飲食組小鼠血清膽固醇水平顯著降低，其肝臟HMG-CoA 還原酶mRNA的表達(dá)量也顯著降低，推測LGG降膽固醇機(jī)制是通過抑制HMG-CoA還原酶活性。

2.3 抑制尼曼-匹克C1樣1蛋白的表達(dá) 膽固醇的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要在小腸進(jìn)行，其中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尼曼-匹克C1樣1蛋白(Niemann-pick C1-like1，NPC1L1)介導(dǎo)膽固醇內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞是膽固醇吸收的關(guān)鍵步驟，抑制NPC1L1表達(dá)可以降低腸道對膽固醇的吸收。Fei等[8]研究結(jié)果表明，LAB4和LAB12降低斑馬魚膽固醇的作用機(jī)制是通過下調(diào)腸細(xì)胞NPC1L1基因表達(dá)。在體外Caco-2細(xì)胞研究中，Le等[20]用植物乳桿菌FB003處理Caco-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞吸收膽固醇降低，其NPC1L1 基因的表達(dá)也受到了抑制。

2.4 產(chǎn)生膽鹽水解酶 腸道膽固醇的吸收依賴于膽酸的乳化作用，膽鹽水解酶(Bile salt hydrolase，BSH)能將結(jié)合型膽酸水解成游離型膽酸，游離型膽酸不易被小腸吸收，隨糞便排出體外。隨著糞便中膽酸鹽排泄量的增加，經(jīng)肝腸循環(huán)回到肝臟的膽汁酸就越來越少，為了補(bǔ)償肝腸循環(huán)過程中失去的膽汁酸，肝臟中的膽固醇會進(jìn)一步分解生成新的膽汁酸，從而達(dá)到降低膽固醇的目的。許多益生菌能產(chǎn)生BSH，包括某些種類的乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬和擬桿菌屬。Sridevi[21]發(fā)現(xiàn)，從乳桿菌ATCC4005分離出BSH可使大鼠血清膽固醇水平降低58%。Michae等[22]通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌Lab4和CUL66有產(chǎn)生BSH的能力，喂養(yǎng)小鼠后其糞便中總膽汁酸和游離膽汁酸水平升高，由此推測，植物乳桿菌Lab4和CUL66降低血清膽固醇是通過在宿主腸道中產(chǎn)生BSH介導(dǎo)膽汁酸凈化作用而增加膽汁從頭合成的結(jié)果。

2.5 提高膽固醇7α-羥化酶活性 體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是降低血清膽固醇的重要途徑，其中7α-羥化酶(7α-Hydroxylase，CYP7A1)是膽汁酸合成的限速酶，提高CYP7A1活性能加快膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的速率。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌 WEFA23能增加肝臟中CYP7A1的表達(dá)水平，促進(jìn)體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽汁酸，并在腸道中被BSH水解后轉(zhuǎn)化為游離膽鹽，從而降低血清膽固醇。Jeun[23]用植物乳桿菌KCTC3928 處理高膽固醇血癥小鼠4周后，發(fā)現(xiàn)其CYP7A1基因表達(dá)量增加了80%，CYP7A1蛋白表達(dá)量增加了60%，血清TC、LDL-C顯著降低，糞便中膽鹽的排泄量增加。

2.6 產(chǎn)生短鏈脂肪酸 益生菌在生長過程中可以利用碳水化合物生成短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid，SCFA)及其鹽類，尤其是丙酸，能夠抑制脂肪酸和膽固醇的合成，丙酸可通過血循環(huán)進(jìn)入肝臟增強(qiáng)/抑制肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)，抑制HMG-CoA還原酶的活性以及增強(qiáng)CYP7A1活性，因此丙酸具有降膽固醇作用。Soyoung等[7]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌BFE5264可顯著降低高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇水平，并伴有丙酸的產(chǎn)生。Guo等[24]研究也表明，干酪乳桿菌F0822降膽固醇作用可能歸因于丙酸產(chǎn)量的增加。

除上述假設(shè)外，其他益生菌降膽固醇假設(shè)還有：吸收同化膽固醇、上調(diào)ABCG-5和ABCG-8表達(dá)量[15]、將膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇[25]等。益生菌降膽固醇機(jī)制是多種多樣的，一種益生菌可能同時存在幾種機(jī)制。因此，需要借助諸多新的方法(如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué))來闡明益生菌降膽固醇的作用機(jī)制。

3 展望

益生菌市場前景非常廣闊，預(yù)計到2020年全球益生菌市場規(guī)?？蛇_(dá)465.5億美元[4]。目前，已經(jīng)研發(fā)成功并上市銷售的益生菌類藥物，如媽咪愛(枯草桿菌二聯(lián)活菌)、金雙歧(雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌)等，在臨床上應(yīng)用廣泛并取得了良好的療效，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。益生菌作為降膽固醇藥物研發(fā)的一種新思路，具有成本相對較低、藥效作用較好、毒副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)化學(xué)藥和中藥相比均具有明顯的優(yōu)勢，是一項(xiàng)值得大力研發(fā)和推廣的領(lǐng)域。

雖然益生菌的開發(fā)具有良好的市場前景，但益生菌的研發(fā)過程中還有諸多的問題有待解決。如體外試驗(yàn)難以完全模擬體內(nèi)環(huán)境，體外有效并不代表體內(nèi)有效。嚙齒類動物模型有效并不代表臨床人類應(yīng)用有效。因此，在益生菌的研發(fā)中應(yīng)把體外試驗(yàn)、體內(nèi)動物模型評價相結(jié)合，方可客觀評價其有效性。安全、有效、質(zhì)量可控是藥物的三大要素，除了有效性和質(zhì)量控制，安全性是作為藥物研發(fā)更需要考慮的問題。為此，建議在降膽固醇類益生菌研發(fā)時可先采用體外試驗(yàn)進(jìn)行有效性篩選，再將有療效的候選菌株用動物模型進(jìn)行驗(yàn)證，然后對有療效的優(yōu)勢菌株進(jìn)行安全性篩選。經(jīng)過有效性和安全性雙重考察，綜合評估有開發(fā)潛力的候選益生菌方可進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究。臨床試驗(yàn)耗費(fèi)巨大、耗時較長，在進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，益生菌的有效性研究中若僅使用嚙齒類動物進(jìn)行研究可能是不足的，因嚙齒類動物外推至人的可信度相對較低，而靈長類動物與人類的遺傳物質(zhì)有75%～98.5%的同源性，是創(chuàng)新藥物研發(fā)中的重要實(shí)驗(yàn)動物。因此，在益生菌有效性研究中若使用與人體生理、病理等特征相似的靈長類動物開展研究，將可大大降低益生菌臨床運(yùn)用的風(fēng)險。