藍 嵐，楊丹嬌，潘 瑤，吳建平，李友英，賀安祥，湯 承

(1. 西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041 ； 2. 甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學研究所，四川 康定 626000 ； 3. 四川省肉牛創(chuàng)新團隊，四川 成都 610041)

四川省甘孜藏族自治州(簡稱甘孜州)位于青藏高原東南緣，是川西北生態(tài)示范區(qū)和國家生態(tài)屏障區(qū)。畜牧業(yè)是甘孜州基礎產業(yè)、傳統(tǒng)產業(yè)和優(yōu)勢產業(yè)，藏綿羊是甘孜州的優(yōu)勢和標志性物種之一，也是高原牧民重要的生產生活資料。梨形蟲病是一種蜱傳寄生蟲病[1]，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)廣泛分布[2]。梨形蟲可感染牛、羊、馬、犬、野生動物，其中部分蟲種如分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens,B.divergens)、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)和獵戶巴貝斯蟲(B.venatorum)還可以感染人[3-4]。梨形蟲病的典型臨床特征為發(fā)熱、溶血性貧血、血紅蛋白尿等，嚴重者可導致死亡[5]； 亞臨床感染可出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩、繁殖性能下降等，給畜牧業(yè)帶來極大的經濟損失[6]。楊輔國等[7]、陳德明等[8]先后對甘孜州部分地方綿羊泰勒焦蟲病流行情況進行報道，此后再沒有其他相關報道。近年來，甘孜州養(yǎng)羊數(shù)量銳減，藏綿羊養(yǎng)殖數(shù)量已從2016年的104萬多頭減至2019年的46萬余頭，很多地方已不再養(yǎng)殖藏綿羊，選擇甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖的主要區(qū)域瀘定、丹巴等9個縣開展甘孜州藏綿羊梨形蟲感染情況調查，對今后甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖產業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 血液樣本 本調查于2018年6月—2019年5月 采集甘孜州9個縣臨床健康羊全血352份，樣本信息如下：鄉(xiāng)城縣19份，瀘定縣43份，色達縣33份， 甘孜縣121份，得榮縣14份，丹巴縣30份，石渠縣32份，白玉縣30份，爐霍縣30份。

1.2 儀器設備 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購自Thermoforma公司；高速離心機，購自Eppendorf 公司；DYY-6型電泳儀，購自北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 全血總DNA提取 采用酚-氯仿法來進行全血總DNA的提取。

1.3.2 檢測方法 采用西南民族大學動物醫(yī)學實驗室建立的梨形蟲的巢式PCR方法進行檢測[9]。引物信息：外上游引物：5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′，外下游引物：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′，擴增片段大小為843 bp；內上游引物：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′，內下游引物：5′-GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC-3′，擴增片段大小為750 bp，靶基因為18S rRNA。反應體系：第1輪反應預混酶12.5 μL，外引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)， 第1輪樣本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。第2輪反應預混酶12.5 μL,內引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)，樣本DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：第1輪反應94 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；16 ℃反應結束。第2輪反應95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應結束。將第2輪PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 蟲種鑒定 從9個縣隨機挑選68份藏綿羊梨形蟲核酸陽性樣本PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到梨形蟲序列。通過NCBI上的BLAST比對，運用Lasergene 7.0 軟件對測得序列進行同源性分析，采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1 000)基于梨形蟲序列構建系統(tǒng)進化樹來鑒定梨形蟲蟲種。

1.4 檢測情況統(tǒng)計分析 對9個縣藏綿羊檢測情況統(tǒng)計，按照半農半牧業(yè)縣(鄉(xiāng)城、瀘定、得榮、甘孜、丹巴、爐霍6個縣)和純牧業(yè)縣(色達、石渠、白玉3個 縣)來劃分進行結果匯總，用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析其差異顯著性。

2 結果

2.1 甘孜州藏綿羊梨形蟲的檢測 本試驗采集的352份藏綿羊全血樣本經巢式 PCR擴增其18S rRNA部分基因序列，其中有147份樣本擴增出目的條帶(750 bp)，梨形蟲平均陽性率為41.76%，部分電泳結果見圖1。

圖1 部分藏綿羊梨形蟲巢氏PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of some nesed-PCR products of Tibetan sheep PiroplasmaM：DL 2 000 DNA 標準； 1～12：藏綿羊全血樣本；N：陰性對照； P：陽性對照M：DL 2 000 DNA marker； 1-12：Blood sample of Tibetan sheep；N：Negative control； P：Positive control

2.2 半農半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲的檢測 甘孜州9個縣中半農半牧業(yè)縣檢出梨形蟲核酸陽性樣本124份，平均陽性率為48.25%。純牧業(yè)縣檢出梨形蟲核酸陽性樣本23份，平均陽性率為24.21%，見表1。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，甘孜州半農半牧縣藏綿羊梨形蟲感染率顯著高于純牧業(yè)縣(P<0.05)。

表1 甘孜州半農半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲檢測結果Table 1 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in the semi-agricultural and semi-pastoral counties and pure animal husbandry counties in Ganzi prefecture

2.3 甘孜州藏綿羊梨形蟲蟲種的鑒定 從甘孜州7個縣(除白玉縣和色達縣)的藏綿羊梨形蟲陽性樣本中隨機挑選68份樣本通過PCR產物測序鑒定蟲種。成功鑒定蟲種3個，其中呂氏泰勒蟲46份，陽性檢出率為67.65%；綿羊泰勒蟲14份，陽性檢出率為20.59%；奧氏巴貝斯蟲3份，陽性檢出率為4.41%。各縣梨形蟲蟲種情況見表2。

表2 甘孜州藏綿羊梨形蟲蟲種檢測結果Table 2 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in Ganzi prefecture

基于PCR產物測序結果進行同源性比對分析并構建進化樹鑒定藏綿羊梨形蟲蟲種。結果顯示，甘孜州藏綿羊感染的46株泰勒蟲序列與GenBank中呂氏泰勒蟲陜西株(MG930123)、緬甸株(LC326005)、貴州株(LC326005)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為呂氏泰勒蟲；感染的14株泰勒蟲序列與GenBank中綿羊泰勒蟲伊朗株(KX273858)、土耳其株(KT851438)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為綿羊泰勒蟲；感染的3株巴貝斯蟲序列與GenBank中奧氏巴貝斯蟲云南株(KY805843、KY805842、KY805840)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為奧氏巴貝斯蟲。

2.4 甘孜州藏綿羊梨形蟲地域分布 甘孜州7個縣中藏綿羊呂氏泰勒蟲分布于瀘定縣、丹巴縣、鄉(xiāng)城縣、得榮縣、爐霍縣和甘孜縣，綿羊泰勒蟲分布于鄉(xiāng)城縣和石渠縣，奧氏巴貝斯蟲分布于鄉(xiāng)城縣。

3 討論

本試驗是首次對甘孜州州內主要藏綿羊養(yǎng)殖的9個縣開展藏綿羊梨形蟲感染情況調查，藏綿羊梨形蟲平均陽性率達到41.76%，因采集樣本均為臨床健康樣本，說明甘孜州藏綿羊梨形蟲亞臨床感染嚴重。甘孜州半農半牧業(yè)縣海拔較低、氣候適宜、植被種類多、牲畜流動大，適合蜱活動和繁殖，藏綿羊梨形蟲感染率顯著高于純牧業(yè)縣，試驗結果與胡廣衛(wèi)等[10]對青海羊泰勒蟲病流行情況調查結果一致，在一些農區(qū)、半農半牧區(qū)、林區(qū)的邊緣及有灌木林存在的地方羊泰勒蟲病常呈地方性流行。

本試驗共鑒定藏綿羊梨形蟲蟲種3個，其中呂氏泰勒蟲感染率為67.65%，為甘孜州優(yōu)勢蟲種；Zhang等[11]對甘肅省舟曲縣綿羊血液進行檢測發(fā)現(xiàn)舟曲縣呂氏泰勒蟲檢出率為67%；鐘維等[9]對采自四川阿壩州壤塘、小金、紅原縣的藏綿羊全血進行檢測，結果顯示，呂氏泰勒蟲陽性率為75.0%。綜上結果表明，呂氏泰勒蟲在青藏高原綿羊中廣泛分布。呂氏泰勒蟲為惡型泰勒蟲，泰勒蟲子孢子隨蜱蟲盯咬進入宿主體內，以裂殖生殖的方式進行繁殖。在繁殖階段，裂殖體可引起淋巴細胞大量增殖，被感染的動物表現(xiàn)出貧血及不同水平的蟲血癥，嚴重者甚至造成宿主死亡[12-13]。本次試驗未對梨形蟲傳播媒介蜱的種類與分布進行調查，需要進一步進行調查研究，同時，由于感染情況較為嚴重，下一步有必要開展甘孜州藏綿羊梨形蟲病的防治工作。