黃燕，周嬙，陳小靈，唐志，何發(fā)毅，馮玉環(huán)，柳華,

(1.鹽亭縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽(yáng) 621600；2.成都市第三人民醫(yī)院·西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610031；3.鹽亭縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 綿陽(yáng) 621600)

腦血管病的致死率在我國(guó)位居首位，其中缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是主要的腦血管事件，約占所有卒中的80%。部分CIS患者發(fā)病后癥狀體征趨于惡化，即早期神經(jīng)功能惡化(early neurologic deterioration，END)。急性CIS期間END較常見(jiàn)，臨床發(fā)生率可高達(dá)40%。END與卒中后結(jié)局不良密切相關(guān)，增加了患者死亡率[1]。因此，研究END預(yù)測(cè)因素加以有效防控極其重要。END發(fā)生危險(xiǎn)因素眾多[2]，由于CIS是一種具有強(qiáng)烈遺傳背景的多因素疾病，且CIS與END病理生理機(jī)制類(lèi)似，因而END的易感基因研究有一定的必要性。位于9p21.3區(qū)域上的INK4座中反義非編碼RNA (antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)基因與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，ANRIL rs2383207則是CIS發(fā)病的易感位點(diǎn)[3]。本研究擬探討ANRIL rs2383207位點(diǎn)及其與傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的交互效應(yīng)對(duì)急性CIS期間END的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用前瞻性巢式病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，連續(xù)收集從2017年12月至2019年6月鹽亭縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的急性CIS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1) CIS診斷符合世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)標(biāo)準(zhǔn)：電子計(jì)算機(jī)斷層掃描/磁共振成像(computed tomography/ magnetic resonance imaging，CT / MRI)檢查及臨床表現(xiàn)，急性起病、局灶神經(jīng)功能缺損并持續(xù)性24 h以上、排除非血管性病因，排除腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血；(2) 發(fā)病48 h內(nèi)入院；(3)同意參與研究。排除有明確原因的繼發(fā)性腦梗死患者和合并嚴(yán)重其它嚴(yán)重疾病的患者，另外，也排除了住院不滿(mǎn)7 d者、接受靜脈溶栓和血管內(nèi)介入治療者及出血轉(zhuǎn)化的患者。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究，參與研究者簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集與評(píng)估 入院24 h內(nèi)，收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括：(1)人口學(xué)特征：年齡、性別、身高、體重，并計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)；(2)腦血管病危險(xiǎn)因素：如高血壓、糖尿病、血脂異常、心房顫動(dòng)、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、卒中、吸煙、飲酒等；(3)部分實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：入院空腹血糖、血常規(guī)、凝血功能，血液生化指標(biāo) [包括超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)，血同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等]。

1.2.2 研究指標(biāo) (1)使用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(national Institute of Health stroke scale，NIHSS)評(píng)估神經(jīng)功能缺損程度；(2)END定義為入院一周NIHSS評(píng)分中運(yùn)動(dòng)功能項(xiàng)增加至少1分或總分增加至少2分[4]；(3)高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHCY)定義為血漿Hcy >10 μmol/L；(4)高危CRP定義hsCRP>3.0 mg/L[5]；(5)高尿酸定義為非同日2次血尿酸水平>420 μmol /L[6]；(6)神經(jīng)功能損傷程度較重定義為NIHSS > 5[7]；(7)入院高血糖根據(jù)1998年WHO標(biāo)準(zhǔn)：空腹 ≥7.0 mmol /L，或隨機(jī) ≥11.1 mmol /L；(8)入院高血壓根據(jù)1999年WHO高血壓標(biāo)準(zhǔn)：即收縮壓 ≥ 140 mmHg(和/或)舒張壓 ≥ 90 mmHg；(9)吸煙史定義為平均每日吸煙1支以上，時(shí)間大于1年；飲酒史定義為平均每周飲白酒至少1次，時(shí)間大于1年[8]；(10)血脂異常依據(jù)2016年修訂版中國(guó)成人血脂異常防治指南：甘油三酯(triglyceride，TG)> 1.7 mmol/L(150 mg/dL)、血清總膽固醇(serum total cholesterol，TC)> 5.20 mmol/L (200 mg/dL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)> 3.40 mmol/L(140 mg/dL)；(11)超重定義為BMI≧24 kg/m2。

1.2.3 rs2383207位點(diǎn)分型 (1)樣本脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)獲取：取受試者外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318-02/03，北京TIANGEN)按說(shuō)明操作。(2)基因分型：采用imLDR多重SNP分型平臺(tái)(上海天昊)[9]。具體操作步驟如下：①DNA樣本工作濃度為5～10 ng/μL；②多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：反應(yīng)體系10 μL包括1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和1 μL引物，見(jiàn)表1。循環(huán)程序?yàn)椋菏紫?5 ℃循環(huán) 2 min；第二步進(jìn)行11個(gè)循環(huán)[94 ℃ 20 sec、65 ℃ 40 sec(每次循環(huán)依次降低 0.5 ℃)、72 ℃ 1.5 min]；第三步進(jìn)行24個(gè)循環(huán)(94 ℃ 20 sec，59 ℃ 30sec，72℃ 1.5 min)；第四步72 ℃ 循環(huán)2 min，4 ℃保存；③PCR產(chǎn)物純化：10 μL PCR產(chǎn)物加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min；④連接反應(yīng)：反應(yīng)體系為10×連接緩沖液1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5’連接引物混合液(1 μM) 0.4 μL、3’連接引物混合液(2 μM) 0.4 μL(表1)、純化后的多重PCR產(chǎn)物 2 μL、ddH2O 6 μL 混勻。連接程序首先進(jìn)行38個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)，4 ℃保存；⑤測(cè)序及分析：取0.5 μL 稀釋后的連接產(chǎn)物與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD和9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3730XL測(cè)序儀，收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1 (ABI，USA) 進(jìn)行分析。

表1 SNP分型所用引物名稱(chēng)及序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析

391例CIS患者納入分析，116例發(fā)生END(29.7%)，非END共275例(70.3%)。兩組在的性別、年齡差異方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。單因素分析發(fā)現(xiàn)，END組NIHSS>5評(píng)分、入院高血糖、HHCY和高危hsCRP值比例明顯高于非END組(P<0.05)。多元Logtic回歸分析調(diào)整協(xié)變量后，兩組NIHSS>5評(píng)分，入院高血糖和HHCY差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 納入研究對(duì)象的特點(diǎn)及Logistic回歸分析

2.2 rs2383207 SNP分析

2.2.1 基因分型及相關(guān)性分析 所有樣本都成功進(jìn)行了rs2383207位點(diǎn)分型，在顯性模型下，GG型增加了END風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整后的GG基因型：OR=2.143，95%CI：1.293-3.550，P=0.003)；在等位基因比較模型下，A等位基因具有保護(hù)效應(yīng)，降低了END發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.691,95% CI：0.497-0.961，P=0.028)。見(jiàn)表3。

表3 不同遺傳模型下rs2383207位點(diǎn)在END組和非END組中的分布

2.2.2 ANRIL基因rs2383207和END傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的交互分析 將END單因素分析中P<0.1的因素(年齡≥65、WBC異常、TIA史、飲酒、糖尿病史、高危hsCRP、HHCY、入院高血糖和NIHSS>5評(píng)分項(xiàng))與391條樣本記錄資料導(dǎo)入MDR軟件，作了1-4階不同交互情況下的模型。結(jié)果顯示，二階交互模型rs2383207和NIHSS>5評(píng)分具有最好的平均檢驗(yàn)準(zhǔn)確度和交叉驗(yàn)證一致性(Testing BA：0.593 3，CVC：9/10，P=0.286)，因此選擇此模型作為最佳模型，Logtic回歸分析顯示NIHSS>5分人群同時(shí)攜帶rs2383207 GG基因型END發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，但是沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=1.696，95%CI:0.607～4.736，P=0.313)。見(jiàn)表4。

表4 rs2383207 SNP與傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素基于1-4階交互作用分析

3 討論

本研究顯示，急性CIS入院7 d內(nèi)END發(fā)生率為29.7%。Hu等[10]研究表明，在中國(guó)人群中，住院CIS患者7 d內(nèi)END發(fā)病率為20.2%～42.5%，與本研究類(lèi)似。

入院NIHSS>5分、入院高血糖和HHCY的患者更容易發(fā)生END。END發(fā)生機(jī)制包括缺乏有效側(cè)枝循環(huán)、血栓進(jìn)展、卒中復(fù)發(fā)、顱內(nèi)壓增加、癲癇和出血轉(zhuǎn)化等。NIHSS評(píng)分與腦梗死或水腫面積密切相關(guān)，梗死后的多種并發(fā)癥及氧自由基釋放可能是患者發(fā)生END的重要原因，并且卒中的嚴(yán)重程度與END發(fā)生率成正比[11]。這可能是由于空腹血糖升高可導(dǎo)致腦組織乳酸和氧自由基等有害物質(zhì)產(chǎn)出增加，加重腦細(xì)胞損傷；高血糖具有血栓前效應(yīng)，可能促使血栓擴(kuò)展；高血糖微血管病變可影響側(cè)枝循環(huán)，使患者對(duì)血壓變動(dòng)更敏感，由此加重低灌注風(fēng)險(xiǎn)，與Jaume等[12]研究基本一致。HCY參與血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)、血管平滑肌增殖過(guò)程，與動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成有關(guān)，而HHCY血癥是腦血管疾病的高危因素，降低HCY的卒中患者預(yù)后較好[13]。且HHCY也是預(yù)測(cè)END的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]，由于HCY與人群END風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs2383207 GG型增加了END風(fēng)險(xiǎn)，A等位基因具有保護(hù)效應(yīng)。ANRIL與心腦血管事件密切相關(guān)，其中ANRIL rs2383207位點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和CIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)息息相關(guān)[15-18]。由此推測(cè)，ANRIL rs2383207可能參與了CIS-END 發(fā)病。

本研究進(jìn)行了ANRIL基因rs2383207位點(diǎn)與END傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素交互作用分析，rs2383207位點(diǎn)與NIHSSS>5兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)可能與END風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，盡管在最后的驗(yàn)證中未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍可推測(cè)，END的發(fā)病可能在一定程度上與遺傳和環(huán)境多種因素交互作用相關(guān)，且在遺傳易感性基礎(chǔ)上，發(fā)病時(shí)的神經(jīng)功能受損的嚴(yán)重程度可能會(huì)增加END的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，ANRIL基因、入院高血糖、HHCY和神經(jīng)功能缺損程度與急性CIS后END發(fā)病有關(guān)，END傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素和易感基因間的交互作用可能參與了END的發(fā)病。