劉志明，郜苗苗，邵麗麗，朱翠敏，劉秀芬

(滄州市中心醫(yī)院兒科，河北 滄州 061000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是常見的自身免疫性疾病之一，臨床表現為皮膚、關節(jié)、腎臟、心血管等多組織器官受累，重癥者若不及時有效治療，可危及生命[1]。既往研究[2-3]表明，過度自噬可導致細胞的長期存活，造成自體成分被作為抗原遞呈，并在自身免疫性疾病的發(fā)生與進展中扮演重要角色。SLE患者及小鼠模型中均存在明顯的自噬異常[4]，而自噬活動改變的機制目前尚未完全明了，自噬基因Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62等在SLE中表達水平及其意義亦不完全清楚[5]。本研究擬通過檢測SLE患兒外周血單核細胞(peripheral blood monocytes，PBMC)中Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62 表達水平及蛋白表達量的變化，探討其在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用，以期尋找新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年8月滄州市中心醫(yī)院確診的50例SLE患兒為研究對象，根據系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分標準[6]分為SLE-1組(初診、未經治療且SLEDAI≥10分)和SLE-2組(經治療且SLEDAI<10分)，每組各25例；另選15名健康兒童為正常對照組(NC組)。本研究本研究經院倫理委員會批準，患兒家長知情同意。三組兒童性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 自身抗體水平檢測 真空管采集患者靜脈血，離心取上清液。間接免疫熒光法檢測血清抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)，試劑購于美國Inova公司；酶聯免疫吸附試驗檢測抗ds-DNA抗體，試劑購于愛爾蘭TrinityBiotech Plc公司；免疫印跡法檢測抗可提取性核抗原抗體，包括抗RNP抗體、抗Sm抗體、抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體，試劑購于德國歐蒙公司。操作及結果判定按試劑說明書進行。

1.2.2 血液相關指標檢測 采用血細胞分析儀及全自動生化分析儀(國羅氏診斷有限公司)檢測血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Sre)、血沉(ESR)等；免疫比濁法檢測補體C3、C4水平，試劑盒購自北京中生公司；采用羅氏 Cobas c701型全自動生化分析儀及其配套試劑檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平。

1.2.3 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62表達水平檢測 采用熒光定量PCR實驗，步驟如下：(1)密度梯度離心法提取PBMC。采集晨起空腹外周靜脈血5 mL，以Hanks液(TIANDZ公司)等體積稀釋，室溫吹打混勻，備用。取2 mL圓底試管，先加入淋巴細胞分離液于底部，再沿管壁加入稀釋血液，保持分層不混勻。20 ℃，2 000 rpm離心20 min，此時圓底試管中分為4層，白色細胞層即為PBMC，吸取細胞并懸浮于Hanks液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)總RNA的提取與鑒定。采用Trizol型RNA試劑盒(美國Invitrogen 公司)提取，操作嚴格按試劑盒說明進行；Alpha1506型分光光度計(上海譜元儀器有限公司)檢驗RNA純度：變性凝膠電泳后，溴化乙錠染色，觀察28S及18S rRNA條帶的清晰度及強度比值，強度比值≈2∶1代表RNA完整性良好。(3)RT-qPCR實驗。配置常規(guī)逆轉錄體系(Catalog公司RT0411-01)，逆轉錄獲取模板cDNA，條件為55 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s；配置PCR體系進行擴增(引物序列見表2)，反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴增40個循環(huán)，每個樣本檢測3次。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各個基因的mRNA表達水平。

1.2.4 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62蛋白表達量測定 采用 Western blotting 法，步驟如下：(1)蛋白提取與定量。全蛋白提取試劑盒(美國Gene Copoeia公司)提取PBMC的總蛋白，BCA法定量后，buffer緩沖液配制成1 μg/μL的蛋白溶液。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳與電轉印。配置電泳體系，以每孔10 μg蛋白用量進行SDS-PAGE電泳，電泳條件：60 V預電泳30 min除去凝膠雜質，調整至90 V電泳 70 min，電泳后蛋白按分子量大小分開，形成條帶，將電泳后的蛋白條帶轉印至NC膜。(3)封閉與孵育。5%脫脂牛奶封閉90 min，PBST清洗3次，5 min/次。一抗孵育，兔抗人BECN1單克隆抗體(美國Abcam公司)、兔抗人ATG5單克隆抗體(美國Abcam公司)、兔抗人ATG7 單克隆抗體(美國Abcam公司)、兔抗人P62單克隆抗體(美國Abcam公司)的濃度分別為1∶2 000、1∶2 500、1∶1 800、1∶2 000，4 ℃ 過夜，PBST清洗3次，5 min/次；二抗(上海碧云天公司)37 ℃孵育90 min，濃度1∶2 500。(4)顯影與定量。ECL熒光顯色，暗室顯影，采用影像分析軟件Image J分析目的條帶和內參條帶的灰度值，目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/內參條帶灰度值。見表2。

表2 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62及內參基因GAPDH引物序列表

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 三組兒童血液相關指標比較

SLE-1及SLE-2組C3、C4、PLT、Hb水平低于NC組(P<0.05)，且SLE-1組低于SLE-2組(P<0.05)；IgG、IgM、IgA、Sre、TG、ESR高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)；抗ANA抗體、抗ds-DNA抗體陽性率高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表3。

表3 三組兒童血液相關指標比較

2.2 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62 mRNA表達水平比較

SLE-1組及SLE-2組Beclin-1、ATG-7及p62 mRNA表達水平高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表4。

表4 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62 mRNA表達水平比較

2.3 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62蛋白表達水平對比

SLE-1組及SLE-2組Beclin-1、ATG-7及p62蛋白表達量高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62蛋白表達水平比較

3 討論

細胞及體液免疫反應的異常、B細胞過度激活產生自身抗體、免疫復合物的沉積是SLE主要的病理特點。本研究中，SLE組C3、C4水平低于NC組(P<0.05)，且SLE-1組低于SLE-2組(P<0.05)；IgG、IgA水平高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)，與既往研究[7]報道一致，提示抗體形成及補體參與了SLE的發(fā)生與發(fā)展。

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性細胞降解途徑，在從酵母細胞到哺乳動物不同生物間高度保守。自噬在細胞分化、氧化應激、細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)的成熟中扮演重要角色。過度自噬可導致細胞的長期存活，引起內含DNA/RNA聚合體的凋亡小體通過與TLR-7等結合激活免疫，將自體成分作為抗原遞呈，是SLE、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病的重要病理機制之一[2]。ATG-5是自噬執(zhí)行的重要分子，主要參與自噬小體成熟[8-9]。Beclin-1與酵母細胞ATG-6同源，是啟動自噬的重要基因[10]和測定自噬水平的常用標志物之一[11]。ATG-7位于自噬囊泡擴張中LC3和Atg12兩個泛素樣系統(tǒng)的中心。p62與酵母細胞ATG-8同源，在蛋白聚集、泛素化底物的運送及降解清除中發(fā)揮重要作用[9]。近年來，自噬影響SLE等自身免疫性疾病的機制是臨床研究的熱點之一[12-13]。

本研究結果顯示，SLE患兒PBMC中Beclin-1、ATG-7及p62基因及蛋白表達水平均高于健康兒童(P<0.05)，與既往研究[8,11]結論一致，說明SLE患兒存在自噬活躍度增加，自噬失衡；SLE-1組患兒Beclin-1、ATG-7及p62基因表達水平及蛋白表達量高于SLE-2組(P<0.05)，提示Beclin-1、ATG-7及p62mRNA的表達不僅與SLE的發(fā)生有關，還與其活動水平存在關聯，據此推斷，藥物治療可能是通過改變自噬水平而實現的；不同活動度的SLE患兒ATG-5基因mRNA及其蛋白表達水平與健康童無明顯差異(P>0.05)。既往研究[8]發(fā)現，ATG-5基因rs6937876等至少5個單核普酸多態(tài)性(Single nucleic acid polymorphism，SNP)與SLE的易感性有關，對發(fā)展成SLE具有重要影響，但ATG-5基因與SLE發(fā)病及病情的相關性有待進一步研究。本研究尚未對目的基因進行細胞或動物實驗以明確其在SLE自噬功能改變中的機制。而自噬合成的增加及分解受阻均可導致自噬動態(tài)平衡打破、細胞自噬功能障礙，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，SLE自噬水平增強，Beclin-1、ATG-7、P62 水平及蛋白量在治療后降低，自噬可能參與了SLE的發(fā)生與發(fā)展，可能是治療的新靶點。