凌麗麗，李桂芳，王彪，趙學輝，劉會領，李建英，王新梅

(1.滄州市人民醫(yī)院新生兒科；2.滄州市公安局刑警支隊，河北 滄州 061000)

雄激素受體(androgen receptor，AR)介導基因能夠通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等非基因途徑對蛋白的合成過程進行調控[1-2]，MAPK信號通路屬于Ser/Thr蛋白激酶家族重要因子，通過適當運動能夠將MAPK信號通路激活，進而誘導抗氧化酶基因表達，提高機體的抗氧化能力，達到預防疾病及延緩衰老的目的[3-4]。p38為MAPK家族的成員之一，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路在細胞凋亡、炎癥反應、骨代謝等過程中均能發(fā)揮重要的調控作用[5-6]。雄激素具有抑制骨骼肌萎縮、促進骨骼肌肥大和肌肉力量的作用，可增強運動能力[7-8]；而運動訓練是預防骨質疏松的有效方式，青少年中長期參加體育鍛煉的人群具有更長、更粗壯的骨骼，且骨骼的質量、形狀與其所處力學環(huán)境密切相關，通過適當運動建立良好的力學環(huán)境能夠改善骨代謝[9-10]。本研究擬探討運動如何通過p38MAPK信號通路影響成長期小鼠骨代謝，為后期臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物模型

40只8周齡C57/BL6雄性小鼠購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號：scxk桂20190002)，體質量為20～22 g。采用隨機數字表法分為運動組和對照組，每組各20只，各組小鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

對照組進行普通飼養(yǎng)，不給予任何干預。運動組第1周運動6 d，前3 d運動30 min/d，后3 d運動45 min/d；第2周～8周運動5 d/周，運動45 min/d，設定跑速為0.8 km/h，坡度-9°。

1.2 方法

1.2.1 生物材料 血清：最后一次訓練結束后的第3天使用斷頭法處死各組小鼠，將眼球摘除后取眼眶血移入1.5 mL離心管內，以5 000 rpm的速率離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱內保留待測。右側脛骨和股骨：將小鼠骨骼表面的肌肉剝離，取出脛骨和股骨，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)將骨組織樣本清洗干凈，分裝在離心管內，置于4 ℃冰箱內保留待測。本實驗中因樣本量較大，且各組小鼠試驗前均為健康小鼠，因此該實驗中僅對右側脛骨和股骨進行觀察。腦：處死小鼠后開顱取腦，在4 ℃下使用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋后切片。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 使用ELISA對血清鈣(serum calcium，Ca)、血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP/ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，STR-ACP)、骨鈣素(osteocalcin，BGP)、血清磷(phosphorus，P)水平進行檢測。儀器為LFF-LC-1781全自動生化分析儀(美國貝克曼生物有限公司)，試劑從邁瑞生物科技有限公司購買(貨號：2020041113)，具有5年以上臨床經驗的專家嚴格按照說明書操作。具體如下：(1)離心取上層血清；(2)在微定量板上吸附組蛋白體；(3)加上清液使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；(4)加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；(5)加酶的底物，測光吸收強度。

1.2.3 生物力學指標檢測 使用微機控制電子萬能試驗機(濟南方圓試驗儀器有限公司；型號：WDW-50E/100E)對小鼠的右側股骨各生物力學指標進行檢測，將股骨放置在兩個支撐點上，標本寬度朝上且水平放置，將探頭下降，以2 mm/min的速度施壓，標本斷裂后停止，依據壓力傳感器數據獲得相應指標數據，包括彈性載荷、最大載荷、破壞載荷、彈性撓度、最大撓度、破壞撓度、能量吸收和剛性系數。具體如下：(1)打開微機控制電子萬能試驗機主機電源、電腦，點擊桌面Smarttest軟件，打開專業(yè)測控軟件；(2)進入拉力機操作界面，首先選擇所使用的試驗方法，此時軟件右側將會顯示數據板欄目；(3)點擊新建按鈕，根據試樣的實際規(guī)格尺寸輸入到數據板里面，完成后關掉數據板；(4)調節(jié)衡量位置，將股骨放置在兩個支撐點上，標本寬度朝上并水平放置；(5)清零試驗數據，確認試樣無異常，點擊界面改到試驗界面，以2 mm/min的速度施壓，標本斷裂后停止；(6)各數據均實時顯示，可記錄或打印。

1.2.4 Western blot印跡檢測 對小鼠的血小板衍生生長因子B(platelet derived growth factor，PDGFb)、c-fos蛋白、細胞外調節(jié)蛋白激酶-1(extracellular regulated kinase protein，ERK-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase，P-MAPK)蛋白表達水平及磷酸化p38(p-P38)、黑質環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)水平進行檢測。(1)分離黑質區(qū)(圖1)：小鼠快速斷頭處死，取出完整腦，將腦至于-80 ℃速凍5 min。取出速凍好的鼠腦，置于冰上，切取前囟(在剝離的鼠腦上，前囟和腹側的視交叉前緣處于同一垂直面上)后，3～4 mm的冠狀切面。在鼠腦切面上，黑質腦區(qū)的顏色是與其它腦區(qū)顏色不同的，有比較清晰的界限，用鑷子或者其它工具挖取獲得。(2)使用Western blot印跡法對小鼠黑質區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平進行檢測。依據試劑盒(邁瑞生物科技有限公司購買；貨號：2020061719)提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(邁瑞生物科技有限公司購買；貨號：2020082111)對裂解物的蛋白濃度進行測定，聚丙烯酰胺凝膠電泳，參照免疫印跡說明進行轉膜等過程，p-P38、COX-2、caspase-3、PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK曝光顯影，重復3次。具體如下：(1)將蛋白電泳后的凝膠浸入電轉緩沖液中15 min。(2)將電轉膜(醋酸纖維素膜)先在甲醇中浸泡至完全濕潤，然后再將膜浸入超純水中5 min，最后再將膜浸入電轉液中15 min。(3)濾紙先在電轉液中完全浸濕，然后將濾紙平鋪在電轉纖維上，在濾紙正上方平鋪凝膠，在凝膠正上方平鋪電轉膜，在電轉膜正上方平鋪濾紙，最后用玻棒趕氣泡。(4)100 V，電轉100 min。(5)電轉結束后，將電轉膜浸泡于甲醇中5 min，最后將電轉膜浸泡于4 mL 10%的牛奶(2 g奶粉溶于20 mL超純水)中(5% BSA)，置于37 ℃搖床(75 rpm)封閉1.5 h(也可4 ℃封閉過夜)。(6)封閉1.5 h結束后，電轉膜用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline+Tween-20，PBST)(1LPBS溶液+500 uL Tween-20)洗3次，每次10 min。(7)將電轉膜浸入一抗溶液中，置于37 ℃搖床，75 rpm，1.5 h(一抗溶液的制備：10 mL的10%脫脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10 uL一抗，即共稀釋了1 000～2 000倍，可根據需要自行設計抗體稀釋倍數)。(8)一抗溶液浸泡結束后，將電轉膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。(9)將電轉膜浸入二抗溶液中，置于37 ℃搖床，75 rpm，1 h(二抗溶液的制備同一抗)。(10)二抗溶液浸泡結束后，將電轉膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。然后，將膜浸泡于底物溶液中顯色，顯色結束后，用濾紙吸干膜上的水分，將膜置于凝膠成像儀中用白光拍照。滴加發(fā)光液凝膠成像儀采集圖像，計算蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值，以反映目的蛋白的表達。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，分析目的蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組血清生化指標水平比較

ELISA法檢測結果顯示，運動組小鼠的Ca、AKP、ALP、STR-ACP、BGP水平均高于對照組，血清P水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 血清生化指標水平比較

2.2 兩組右側股骨生物力學指標比較

微機控制電子萬能試驗機檢測結果顯示，運動組小鼠股骨生物力學指標均優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 右側股骨生物力學指標比較

2.3 兩組PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表達水平比較

Western blot印跡法檢測結果顯示，運動組小鼠的PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白的表達水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表達水平比較

2.4 兩組黑質區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平比較

Western blot印跡法檢測結果顯示，運動組小鼠的黑質區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 黑質區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平比較

3 討論

Goodyear等[11]在1996年就運動對大鼠骨骼肌細胞ERK1/2、p38、JNK信號分子的激活作用進行了探究，近年來，骨骼肌中的MAPK信號轉導通路的調節(jié)問題逐步成為研究的熱點，肌肉收縮與運動對p38MAPK信號轉導通路的調節(jié)作用備受關注[12-13]。謝學海等[14]發(fā)現，人體和正常大鼠耐力運動后，48 h骨骼肌p38蛋白活性與含量受影響。同時，陳彤丹等[15]也指出，在相同的相對強度運動下，接受過運動訓練的患者骨骼肌p38MAPK信號轉導通路具有更強烈的反應。

生長發(fā)育期內的骨量增加所達到的峰值大小，對于人群老年時期發(fā)生骨質疏松有著重要作用。p38MAPK是含有360個氨基酸的絡氨酸磷酸化蛋白激酶，臨床中能夠激活p38的刺激較多，熱休克、蛋白質合成抑制劑、高滲透壓環(huán)境等應激刺激及脂多糖等均能激活p38通路[16]。此外，骨質疏松癥的發(fā)生與維生素D的缺乏密切相關，維生素D水平低下，膳食中鈣質攝取量較低，長時間會造成骨量丟失[17]。維生素D是免疫調節(jié)中的重要成分，其在免疫系統(tǒng)多種成分中可作為自分泌及旁分泌信號系統(tǒng)，免疫調節(jié)中需要消耗大量的維生素D[18]。

本研究顯示，運動組的各血清生化指標、右側股骨生物力學指標均優(yōu)于對照組，進一步探究發(fā)現觀察組小鼠的MAPK信號通路相關因子(PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK)、BMP-2 mRNA相對表達量及p-P38、COX-2、caspase-3水平均優(yōu)于對照組。這可能是由于運動激活了p38分子，并刺激了其下游信號分子MAPKAPK2，將核底物直接磷酸化，增強了底物的活性。調控骨代謝的重要手段之一為運動訓練，其不僅能夠增加骨量，還能夠促進骨形成代謝，適宜的運動刺激能夠有效促進骨形成[18-19]。本研究中運動組大鼠通過運動改善了骨代謝，減少了對維生素D的消耗，原因可能為維生素D與鈣離子結合形成鈣維生素D復合物，對甲狀旁腺及細胞因子進行了調控，減少了骨吸收量，降低了皮質骨多孔的發(fā)生率，刺激骨鈣素、骨橋蛋白等骨基質蛋白及骨生長因子的生成，促進骨微細損傷的修復和骨礦化，調節(jié)了骨重建，進而改善了骨代謝[20]。

綜上所述，運動能夠激活成長期小鼠的p38MAPK信號通路相關細胞因子的表達，改善骨代謝，增加骨密度。