李元超,吳 瑋,3*,王 剛,屈昌北,王 磊,李保衛(wèi),韓浩倫,李 丹,劉 鋼

(1北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院耳鼻咽喉科,北京 100101;2中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉科;3國家環(huán)境保護環(huán)境感官應(yīng)激與健康重點實驗室;4首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;*通訊作者,E-mail:ent306ww@126.com;#共同通訊作者,E-mail:wanggang306yy@126.com)

內(nèi)毛細胞帶狀突觸(ribbon synapses,RS),即內(nèi)毛細胞(inner hair cell,IHC)與Ⅰ型螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGNs)形成的突觸,因前膜活化區(qū)內(nèi)錨定有含C末端結(jié)合蛋白2(C-terminal binding protein 2,CtBP2)的特定結(jié)構(gòu)——帶狀體得名,每個IHC可通過帶狀體與多個SGNs形成RS,由其負責(zé)完成聲信號的機械-電換能過程并向中樞方向傳導(dǎo),對聲音的編碼具有決定性作用[1]。RS對多種理化因素都非常敏感,易受噪聲、耳毒性藥物以及衰老等影響發(fā)生損傷且難以恢復(fù)[2]。失重可導(dǎo)致航天性聽損傷,表現(xiàn)為聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)閾值暫時性、甚至永久性閾移,嚴重時可增加宇航員執(zhí)行任務(wù)的失敗風(fēng)險、縮短職業(yè)壽命[3,4]。有學(xué)者在模擬失重大鼠海馬組織中觀察到突觸活動區(qū)范圍明顯減少[5]。但耳蝸RS是否會受到失重影響而發(fā)生改變尚不明確。因此,本研究通過觀察模擬失重后大鼠聽功能及突觸帶狀體數(shù)量的變化,探討失重對聽覺器官的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48只8周齡雄性SD大鼠(購自斯貝福公司)隨機均分為模擬失重組和空白對照組,每組24只;再依據(jù)暴露時間隨機分為1周、4周組,每組12只24耳。模擬失重組大鼠暴露期間始終保持模擬失重狀態(tài);空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)。在暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)和脫離暴露環(huán)境7 d(P7)進行雙耳ABR閾值和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)檢測,并在P0和P7測聽結(jié)束后分別處死每組6只大鼠,再解剖分離雙側(cè)耳蝸。P7時各組測聽耳數(shù)減半,為12耳。實驗前所有大鼠均無噪聲及耳毒性藥物接觸史,雙側(cè)耳廓、外耳道及鼓膜未見異常。

1.2 模擬失重方法

采用經(jīng)典的頭低位模擬失重法(Morey Holton法)[6]:大鼠頭低位、前肢承受部分重量,后肢離地,身體縱軸與水平面成-30°。懸吊期間大鼠可以自由進食水,頭部可自由活動。

1.3 聽力學(xué)檢測

1.3.1 ABR閾值檢測 分別于B0、P0、P7時,采用10%水合氯醛溶液4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,置于37 ℃恒溫電熱毯上,使用聽性腦干反應(yīng)儀(ICS Chartr EP,Medsen)在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)檢測雙耳ABR閾值。刺激聲為短聲(click),強度為80-5 dB連續(xù)測定,衰減間隔10 dB,接近閾值時改為5 dB,以可以重復(fù)的Ⅲ波的最低強度為閾值。

1.3.2 DPOAE檢測 選擇初始純音的頻率f1和f2,頻率比f2/f1=1.21;初始音強度L1和L2,強度差L1-L2=10 dB聲壓級(sound pressure level,SPL)。以兩個初始音頻率的幾何均數(shù)f0為測試頻率,疊加1 024次,取2f1-f2處聲信號幅值與本底噪聲差值>6為DPOAE引出,選擇f0分別為2,4,8 kHz,測試耳在所有測試頻率上的DPOAE全部引出時方可記為DPOAE通過。

1.4 RS免疫熒光染色檢測

分離的耳蝸采用4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣處理后,在解剖顯微鏡下剝離基底膜。于10%山羊血清37 ℃封閉后,采用兔CtBP2抗體(Abcam公司,稀釋比例1 ∶400)4 ℃孵育過夜,山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司,稀釋比例1 ∶400)室溫孵育1 h;DAPI染色,在體視顯微鏡下鋪片,抗熒光猝滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP8)下觀察并對突觸帶狀體進行計數(shù),評估RS損傷情況。

1.5 耳蝸RS計數(shù)

參考Viberg的方法,在計數(shù)時以頂回為0%,底回為100%,整個基底膜從頂回至底回分段計數(shù),按照距頂端平均距離共取10個計數(shù)段。每個計數(shù)段用40倍(oil)物鏡拍攝,然后在其中選取邊長145 μm的正方形為計數(shù)視野,每個視野計數(shù)13-18個相連的IHC細胞核及RS數(shù)量,最后依據(jù)整個基底膜樣本觀察到的突觸總數(shù)和IHC總數(shù)計算整個基底膜上平均每個IHC的帶狀體數(shù)量(個/IHC)[7]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值結(jié)果

各實驗組在B0、P0、P7時的ABR閾值見表1。B0時空白對照1周組、模擬失重1周組、空白對照4周組和模擬失重4周組間ABR閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義;空白對照1周組和空白對照4周組內(nèi)在B0、P0、P7時ABR閾值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模擬失重1周和模擬失重4周組在P0時的ABR閾值較B0時顯著升高(P=0.001,P<0.001),且模擬失重4周組ABR閾值高于模擬失重1周組(P=0.001)。模擬失重1周和4周組大鼠在P7時的ABR閾值較B0時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.833,0.955)。

表1 各組暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)及脫離暴露環(huán)境7 d(P7)ABR閾值

2.2 DPOAE結(jié)果

各組間大鼠在B0、P0和P7時的DPOAE引出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)及脫離暴露環(huán)境7 d(P7)DPOAE引出情況

2.3 免疫熒光結(jié)果

模擬失重后大鼠耳蝸IHC細胞核移位、排列散亂,至P7時有所恢復(fù)(見圖1)。各組大鼠突觸計數(shù)結(jié)果見表3。模擬失重1周組在P0時帶狀體數(shù)量較空白對照1周組下降53.23%,到P7時該組帶狀體數(shù)量仍比空白對照1周組低31.61%;而模擬失重4周組在P0時的帶狀體數(shù)量較空白對照4周組下降了61.19%,到P7時該組的帶狀體數(shù)量比空白對照4周組低39.12%?？瞻讓φ?周組在P0和P7時的帶狀體數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.074);空白對照4周組在P0和P7時的帶狀體數(shù)量差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.295)。在P0時,模擬失重1周組較空白對照1周組、模擬失重4周組較空白對照4周組的突觸帶狀體數(shù)量均明顯減少(P<0.001),且模擬失重4周組大鼠P0時突觸帶狀體數(shù)量減少較失重1周組更明顯(P<0.001);模擬失重1周組和模擬失重4周組在P7時突觸帶狀體數(shù)量均較P0時數(shù)量增多,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),但仍分別低于空白對照1周組和空白對照4周組(P<0.001),且模擬失重4周組低于模擬失重1周組(P<0.001)。

白色短箭頭所示為IHC細胞核,白色長箭頭表示CtBP2標記的突觸帶狀體,黃色長箭頭表示移位的IHC細胞核圖1 各組大鼠免疫熒光染色結(jié)果Figure 1 Immunofluorescence staining results of rats in each group

表3 各實驗組P0、P7內(nèi)毛細胞突觸帶狀體計數(shù)

2.4 帶狀體數(shù)與ABR閾值相關(guān)性分析

對大鼠RS帶狀體數(shù)量與ABR閾值進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示RS帶狀體數(shù)量與ABR閾值負相關(guān)(r=-0.759,P=0.029,見圖2)。失重組大鼠ABR閾值在暴露結(jié)束后即刻最高,脫離暴露環(huán)境7 d后恢復(fù)至暴露前水平,而突觸帶狀體數(shù)量在暴露結(jié)束后即刻到達最低水平,脫離暴露環(huán)境7 d后部分恢復(fù)。

圖2 突觸帶狀體數(shù)量與ABR閾值相關(guān)性分析結(jié)果Figure 2 Correlation analysis between RS ribbon count and ABR threshold

3 討論

天宮二號在軌飛行30 d任務(wù)圓滿完成標志著中國人在太空的駐留時間記錄刷新,較長時間太空飛行潛在的健康問題也受到更多關(guān)注。既往研究[8,9]表明模擬失重可引發(fā)聽覺損傷,表現(xiàn)為ABR閾值升高;而損傷機制的研究主要集中于耳蝸毛細胞纖毛紊亂、凋亡和缺失等形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變。本研究中模擬失重4周內(nèi)大鼠ABR閾值隨暴露時間延長而提高,且耳蝸IHC表現(xiàn)為核移位、排列散亂,但這些變化均可逆。在以上可逆性損傷之外是否存在聽覺傳入通路上其他敏感部位的損傷,是本研究重點關(guān)注的內(nèi)容。

耳蝸RS因前膜活化區(qū)內(nèi)錨定有含CtBP2的帶狀體得名。含神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的突觸囊泡大量栓系在帶狀體表面,突觸后膜上表達相應(yīng)受體[1]。外界聲音信號經(jīng)過機械-電轉(zhuǎn)化使突觸前膜發(fā)生去極化,引起活化區(qū)CaV1.3L型鈣通道開放、Ca2+內(nèi)流觸發(fā)谷氨酸釋放,作用于突觸后膜上的受體,引起突觸后膜去極化,聲信號開始在聽神經(jīng)上傳導(dǎo)[10]。任何導(dǎo)致RS病變的因素均可造成其后的聽神經(jīng)纖維無法興奮,損傷聽功能。自Liberman等[11]提出噪聲暴露原發(fā)性損傷耳蝸RS,而毛細胞缺失和SGNs退行性改變繼發(fā)于RS損傷的觀點以來,越來越多的研究[12-14]表明RS是聽覺系統(tǒng)中對各種理化因素作用非常敏感的部位,其損傷或丟失常早于內(nèi)、外毛細胞的損傷。鄧子宣等[5]研究表明模擬失重2周大鼠CA1海馬神經(jīng)元的突觸間隙和神經(jīng)元活動區(qū)長度顯著減少;王婷梅等[15]在尾吊4周大鼠的海馬組織中發(fā)現(xiàn)突觸后膜興奮性離子型谷氨酸受體的表達明顯下調(diào)。這些研究均表明失重對神經(jīng)中樞突觸造成損傷,而失重環(huán)境對耳蝸RS是否產(chǎn)生損傷及具體損傷表現(xiàn)缺乏報道。

本研究使用免疫熒光染色法,以CtBP2抗體標記耳蝸突觸帶狀體并進行計數(shù),評估模擬失重后的帶狀突觸損傷。結(jié)果表明模擬失重可導(dǎo)致RS數(shù)量減少:模擬失重1周組突觸帶狀體數(shù)量較空白對照組下降53.23%,模擬失重4周組帶狀體數(shù)量進一步減少,較空白對照組下降61.19%。目前認為各種理化因素損傷RS的機制可能有內(nèi)耳缺血、活性氧、自由基損傷以及突觸后Ca2+超載等[2,16]。模擬失重導(dǎo)致RS數(shù)量減少可能的機制主要有兩方面;一方面,失重引起的體液頭向分布可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、內(nèi)耳淋巴液容積增大[17],到達一定程度后血流減少,影響氧供和代謝,打破機體正常的氧化與抗氧化的平衡體系[18],在內(nèi)耳可表現(xiàn)為大量的氧自由基蓄積造成損傷;另一方面,失重也會引起機體內(nèi)多種細胞Ca2+濃度變化,導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,鈣信號異常[19,20]。而耳蝸IHC的L型鈣離子通道(CaV1.3)和Ca2+穩(wěn)態(tài)對IHC發(fā)育和RS突觸前膜的活躍必不可少,內(nèi)毛細胞RS突觸前膜CaV1.3開放、Ca2+內(nèi)流是誘發(fā)突觸囊泡與細胞膜融合、神經(jīng)遞質(zhì)Glu釋放的關(guān)鍵步驟[10]。若失重狀態(tài)下IHC內(nèi)的Ca2+濃度以及Ca2+通道電流改變,也可能導(dǎo)致RS數(shù)量變化。

脫離暴露環(huán)境7 d后突觸帶狀體計數(shù)顯示,模擬失重1周組和模擬失重4周組的帶狀體數(shù)量在P7時均有所恢復(fù),但仍與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示模擬失重4周內(nèi)可能已對RS造成了部分不可逆損傷。目前關(guān)于帶狀突觸損傷的研究結(jié)果因暴露條件和研究對象而有差異,但均表明耳蝸內(nèi)毛細胞RS是易損傷、難恢復(fù)的敏感結(jié)構(gòu)[11-14,21]。哈佛大學(xué)的Liberman等[11]發(fā)現(xiàn)成年小鼠單次100 dB SPL噪聲暴露2 h導(dǎo)致的ABR閾移雖然可以完全恢復(fù),但帶狀突觸數(shù)量卻僅能恢復(fù)50%,并存在SGN的慢性退行性死亡;Furman等[21]研究表明106 dB SPL白噪聲暴露2 h后的豚鼠,2周后ABR和DPOAE閾值完全恢復(fù)正常,但內(nèi)毛細胞上有多達30%的突觸缺失。這提示我們失重后RS損傷短期內(nèi)雖然不伴有ABR閾值的永久性閾移,但其有限的自我修復(fù)能力可能對聽覺系統(tǒng)造成繼發(fā)性損傷。本研究顯示模擬失重4周內(nèi)的ABR閾移在脫離失重環(huán)境7 d后完全恢復(fù),但RS數(shù)量仍存在39.12%的缺失,若RS數(shù)量不能隨著恢復(fù)時間延長進一步增多,可能在遠期造成繼發(fā)性聽損傷。

本研究對模擬失重環(huán)境后大鼠RS帶狀體數(shù)量變化進行了初步觀察研究,明確了模擬失重會導(dǎo)致其數(shù)量減少,且脫離暴露環(huán)境后RS有一定程度的恢復(fù),但恢復(fù)期設(shè)定較短,有必要在今后的研究中延長恢復(fù)期,明確遠期的RS恢復(fù)程度及聽功能水平。模擬失重導(dǎo)致的RS損傷對聽功能影響的具體特點尚不明確,還需在下一步研究中結(jié)合反映RS功能的復(fù)合動作電位以及ABRⅠ波振幅、潛伏期等檢測指標來確定。