王佳楠，汪德會，李 攀，王遠(yuǎn)蘭，趙宗鈴，彭遠(yuǎn)義

(西南大學(xué) 動物科技學(xué)院，重慶400700)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種革蘭陰性條件致病菌，根據(jù)其莢膜抗原的不同可分為A、B、D、E和F共5種血清型[1]，其中牛源A型多殺性巴氏桿菌作為牛呼吸道正常棲息菌，在應(yīng)激條件下引起的牛呼吸道疾病綜合征可給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制尚不明確，研究其致病機(jī)制可對多殺性巴氏桿菌病的防控提供理論依據(jù)。

細(xì)菌溶血素是細(xì)菌分泌的一類外毒素。目前，已知細(xì)菌、對蝦[3]、微藻[4]、植物病原體[5]、螺旋體[6]、支原體[7]等生物皆能分泌溶血毒素?？煞譃橹貜?fù)子毒素家族(repeats in toxin family，RTX)、膽固醇依賴細(xì)胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family，CDC)以及其他類。重復(fù)子毒素家族蛋白的概念在1991年首次被提出，該家族蛋白的羧基(C)端有一段富含甘氨酸-天冬氨酸的九肽重復(fù)序列(G-G-XG-(N/D)-D-x-(L/I/F)-X)，該區(qū)域內(nèi)含Ca2+結(jié)合位點；在氨基(N)末端區(qū)域具有疏水結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可參與靶膜孔的形成；該家族蛋白通過Ⅰ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞外后結(jié)合Ca2+而激活，并與宿主細(xì)胞膜相互作用[8]。膽固醇依賴型細(xì)胞溶素(cholesterol dependent cytolysins，CDCs)是一種成孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，后發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌也能分泌此類毒素[9]。大多數(shù)CDC家族成員之間具有較高的相似性，其基本特征是該毒素結(jié)構(gòu)域4(domain 4)的L1環(huán)(Loop 1)含有一段保守的膽固醇識別基序(cholesterol recognition motif，CRM)ECTGLAWEWWR，可與靶膜上的膽固醇受體發(fā)生結(jié)合，從而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)[10]。其他類中像磷脂酶具有磷酸二酯酶(如PLC和PLD)和?；饷?如PLA1，PLA2，PLB)的活性[11]。目前，與溶血功能相關(guān)且研究得較多的有磷脂酶A1，A2和C。例如，嗜肺桿菌plaB是編碼主要細(xì)胞相關(guān)磷脂酶A的基因，可能由于其溶血活性而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞毒性[12]。

作為重要的毒力因子，溶血素可通過損傷細(xì)胞組織、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活補體和促進(jìn)炎癥反應(yīng)等參與細(xì)菌的致病作用。多殺性巴氏桿菌的溶血性可為我們探究其致病機(jī)制提供新的思考方向，即其是否也分泌溶血素樣蛋白進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，殺傷組織細(xì)胞。如α-溶血素在宿主細(xì)胞膜上形成孔洞后可通過NLRP3炎性小體激活caspase-1,進(jìn)而切割I(lǐng)L-1β前體轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β,并導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生[13-14]。我們實驗室前期發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌感染可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活，進(jìn)而導(dǎo)致caspase-1的激活和IL-1β的分泌[15]。厭氧條件下出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象讓我們猜測多殺性巴氏桿菌是否也產(chǎn)生溶血素樣蛋白發(fā)揮類似作用，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活進(jìn)而導(dǎo)致炎性因子分泌。另一方面，α-溶血素分泌系統(tǒng)是目前研究最透徹的革蘭陰性菌Ⅰ型分泌系統(tǒng)，由HlyB，HlyD，TolC 3個蛋白組成。我們在PmCQ2的蛋白組中發(fā)現(xiàn)了TolB，TolC的存在，如果引起溶血的也是HlyD家族蛋白，那么對于確定多殺性巴氏桿菌的分泌系統(tǒng)便具有指導(dǎo)價值，同時在理論上可以使用此分泌系統(tǒng)構(gòu)建分泌型活載體疫苗，為巴氏桿菌病的防控提供新思路。

蛋白組學(xué)的應(yīng)用非常廣泛，在微生物方面，可用于研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制、致病機(jī)制、本身的生理特性機(jī)理以及新型疫苗的研發(fā)等[16]。例如，RAY等[17]用label free蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了水解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)中的一個溶血素基因(VPRH)，并闡明該基因可使HeLa細(xì)胞肌動蛋白重排且具有毒性作用，是一個重要的毒力因子。本研究旨在用蛋白組學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析，以期篩選到多殺性巴氏桿菌可能的溶血因子，為其溶血機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及動物牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ1～PmCQ7，PmB ，PmF和禽源PmQ分離并暫存于本實驗室,根據(jù)形態(tài)特征、生化特性、16SrRNA基因序列分析以及對物種特異性基因Kmt-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定以上所用菌株為多殺性巴氏桿菌，進(jìn)一步通過PCR擴(kuò)增血清特異性基因hyaD-hyaC，bcbD，dcbF，ecbJ和fcbD確定所用菌株的莢膜血清型[18]；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于重慶拓世眾和生物公司；pET-32a(+)和pET-30a保存于本實驗室。

4～5周齡雌性昆明小鼠(18～22 g)、成年新西蘭大白兔購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑馬丁肉湯、LB肉湯、BHI肉湯均購于海博生物公司。IPTG、卡那霉素、氨芐西林鈉、50倍TAE電泳緩沖液、丙烯酰胺/甲叉29∶1,30%溶液、1.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.8)、1 mol/L Tris-HCl溶液(pH6.8)、10% SDS溶液均購自上海生工有限公司；甘氨酸、tris、脫脂奶粉購于BIOFROX公司；細(xì)菌mRNA提取試劑盒購自于天漠生物公司；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根公司；ECL顯色液和BCA試劑盒購于碧云天公司。

1.3 引物設(shè)計引物序列來源于牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2(CP033599)基因組，引物合成自上海生工生物公司(表1)。

表1 引物序列

1.4 PmCQ2的溶血活性分析從-80℃冰箱取出PmCQ2種子液，劃線接種于馬丁固體血培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，挑取單菌落接種于馬丁試管液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 h左右至對數(shù)期，即得到可使用的活化菌株。將活化的菌液分別劃線接種于馬丁、LB和BHI兔血平板，每種肉湯固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)，操作重復(fù)2次，然后將其分別放置于有氧和厭氧恒溫(37℃)培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)觀察3～5 d，觀察溶血情況。

PmCQ2先有氧培養(yǎng)再厭氧培養(yǎng)，大致步驟同上，將PmCQ2分別劃線于馬丁兔血平板和LB兔血平板，先放置于有氧條件的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后，觀察并記錄溶血情況；然后將PmCQ2生長良好的平板轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h，觀察并記錄此時的溶血情況。

1.5 其他血清型Pm的溶血活性分析將PmCQ1～PmCQ7，PmB ，PmF和PmQ菌株按照1.4步驟，觀察并記錄溶血情況。

1.6 制備蛋白樣品及送樣按照1.4方法活化多殺性巴氏桿菌PmCQ2，將對數(shù)期的菌液原菌涂布接種于12個馬丁兔血平板(并以劃線培養(yǎng)作為溶血現(xiàn)象的觀察)，將平板分別放置于有氧恒溫(37℃)培養(yǎng)箱及厭氧恒溫培養(yǎng)箱，有氧培養(yǎng)12 h，厭氧培養(yǎng)65 h，用無菌細(xì)胞刮收集菌體于無菌凍存管，速凍液氮后于-80℃保存?zhèn)溆?，有氧組(對照組)及厭氧組(試驗組)各設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，各組別分別命名為X2，X3和X4以及Y1，Y2和Y3。將樣品用干冰運輸至杭州景杰生物公司。

1.7 qRT-PCR轉(zhuǎn)錄水平驗證熒光定量PCR驗證蛋白組數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄水平，按照mRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌樣品RNA，酶標(biāo)儀測濃度后按照天根公司FastKing反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以5 μL SYBR熒光定量酶，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，dd H2O 3 μL進(jìn)行qRT-PCR。

1.8 Western blot蛋白水平驗證用大腸桿菌BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)所驗證蛋白，將純化的蛋白與佐劑按4∶1混合，皮下多點免疫小鼠，二免后對小鼠斷尾采血，收集血清即為一抗。取送樣時的全菌蛋白裂解液上清，蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用添加0.05%脫脂奶粉的TBST混合液37℃封閉，洗滌液清洗5次后加一抗于4℃過夜孵育，再次洗滌后進(jìn)行二抗孵育1 h，最后取等量ECL顯色液A/B混勻，用蛋白成像儀顯色成像。

1.9 假定溶血因子的分析及篩選根據(jù)蛋白組學(xué)結(jié)果和溶血素本身的性質(zhì)特點，主要從蛋白差異表達(dá)倍數(shù)及注釋、蛋白的亞細(xì)胞定位、蛋白結(jié)構(gòu)域及其家族主要功能幾個方面進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 PmCQ2在有氧及厭氧條件下的溶血情況結(jié)果顯示有氧條件下PmCQ2在馬丁兔血平板上沒有溶血活性，而厭氧條件下其在馬丁、BHI及LB兔血平板上均有明顯的溶血活性。接種于馬丁、LB兔血平板的PmCQ2，先有氧培養(yǎng)12 h，不具有溶血活性，而轉(zhuǎn)移至厭氧條件再培養(yǎng)72～96 h時可出現(xiàn)溶血活性(圖1)。

A.PmCQ2在有氧和厭氧條件下,于馬丁、BHI及LB兔血平板分別培養(yǎng);1.馬丁有氧條件;2.馬丁無氧條件;3.BHI厭氧條件;4.LB厭氧條件;B.PmCQ2于馬丁、LB兔血平板，先有氧培養(yǎng)后厭氧培養(yǎng);5.LB有氧條件;6.LB平板轉(zhuǎn)移至厭氧條件;7.馬丁有氧條件;8.馬丁平板轉(zhuǎn)移至厭氧條件

2.2 不同血清型多殺性巴氏桿菌的溶血情況經(jīng)多次試驗重復(fù)驗證，厭氧培養(yǎng)條件下，牛源A型PmCQ1 ～ PmCQ7，B型PmB ，F(xiàn)型PmF和禽源PmQ分別在LB，馬丁及BHI兔血平板上均具有溶血活性(表2)。

表2 不同血清型多殺性巴氏桿菌的溶血情況

2.3 蛋白提取及濃度測定細(xì)菌蛋白濃度測定用BCA法進(jìn)行，濃度如表所示,達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

表3 蛋白樣品質(zhì)量濃度

2.4 差異表達(dá)蛋白定量結(jié)果多殺性巴氏桿菌在厭氧條件具有溶血表型，其厭氧條件(PMCQ2_Y)下較有氧條件(PMCQ2_X)而言，蛋白發(fā)生了顯著的變化，以ratio>1.2倍(或ratio<0.83)為差異表達(dá)變化閾值，以統(tǒng)計學(xué)t檢驗P<0.05為顯著性閾值，PMCQ2_Y/ PMCQ2_X比較組中有164個蛋白表達(dá)上調(diào)，282個蛋白表達(dá)下調(diào)(圖2)

圖2 不同比較組中差異表達(dá)蛋白數(shù)量分布柱形圖

2.5 亞細(xì)胞定位分類所有的差異蛋白亞細(xì)胞定位顯示(圖3)，有270，95，47，24和10個蛋白亞細(xì)胞分別定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)、內(nèi)膜、外膜和胞外，同時占所有差異蛋白的比例分別為60.54%，21.3%，10.54%，5.38%和2.24%。

圖3 差異蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分布圖

2.6 差異表達(dá)蛋白的富集分析對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分類、KEGG通路和蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析，為發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白在某些功能類型上是否存在顯著性的富集趨勢。對富集檢驗P值用氣泡圖方式顯示差異蛋白的顯著富集(P<0.05)。

2.6.1GO功能的富集分析 將P<0.05的GO term的顯著富集差異蛋白進(jìn)行分類，結(jié)果如表4所示，在細(xì)胞組分中差異蛋白主要富集在胞質(zhì)部分、核糖體、內(nèi)核蛋白復(fù)合體、非膜細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)非膜細(xì)胞器等條目；在分子功能中主要富集在核糖體的結(jié)構(gòu)組成、過度金屬離子結(jié)合和鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運活性等條目；在生物進(jìn)程中主要富集在肽聚糖的生物合成、鐵離子結(jié)合和細(xì)胞蛋白復(fù)合物組裝等條目。

表4 差異蛋白GO功能顯著富集分布

2.6.2蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析 由圖4可見，差異蛋白主要聚集于Single hybrid motif結(jié)構(gòu)域、Biotin/lipoyl attachment結(jié)構(gòu)域、ABC轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)結(jié)合域、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域、未知功能(DUF21)結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)運相關(guān)結(jié)構(gòu)域等。

圖4 差異蛋白蛋白結(jié)構(gòu)域富集分布圖

2.6.3差異蛋白pathway富集分析 如圖5可見，差異蛋白主要富集于核糖體(ribosome)、肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)、脂肪酸代謝和生物合成(fatty acid metabolism and biosynthesis)通路、丁酸酯代謝(butanoate metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))(citrate cycle，TCA cycle)和丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)等通路。

圖5 差異蛋白pathway富集分布圖

2.7 qRT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平驗證蛋白組結(jié)果選取8個差異蛋白(Pm1264，Pm1081，Pm0040，Pm0634，Pm0441，Pm0057，Pm1427和Pm1384)在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗證，X-12和Y-65分別表示有氧條件及厭氧條件的取樣時間點。結(jié)果如圖6所示，蛋白的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白的表達(dá)趨勢基本一致。

圖6 蛋白組結(jié)果轉(zhuǎn)錄水平驗證

2.8 Western blot在蛋白水平驗證蛋白組結(jié)果Pm2109，Pm2214和Pm769蛋白根據(jù)預(yù)測結(jié)果均有溶血素家族蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域，且在厭氧條件下表達(dá)均上調(diào)，故選取該3個蛋白進(jìn)行蛋白水平驗證，其ratio(Y/X)值分別為1.262，1.232和1.085，由圖7可見(每孔上樣量為10 μg)，Pm2214及Pm769在厭氧組別中(Y1，Y2，Y3)的表達(dá)(灰度值)比有氧組別多，結(jié)果與蛋白組測定結(jié)果基本一致，而Pm2109的表達(dá)差異不明顯。

圖7 蛋白組結(jié)果蛋白水平驗證

2.9 假定溶血因子的篩選及分析對于假定溶血因子的篩選一方面是參考在其他細(xì)菌已報道的溶血素，從所得蛋白的注釋、基因家族功能以及本身功能作用等方面作篩選；另一方面則是需要去挖掘未知的可能與溶血素相關(guān)的蛋白作為候選因子，這部分主要從差異蛋白的差異倍數(shù)并結(jié)合注釋、亞細(xì)胞定位等經(jīng)綜合分析后作篩選。

2.9.1基于差異表達(dá)倍數(shù)及亞細(xì)胞定位篩選 結(jié)果如表5所示，0040是基因ID CQ2GL000040的簡稱， 以及0090，0057均為假定蛋白，沒有功能注釋，在厭氧條件下顯著高表達(dá)于有氧條件，雖然0040，0057等亞細(xì)胞定位顯示在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)膜，但有可能對溶血素效應(yīng)蛋白起調(diào)控或者轉(zhuǎn)運作用，如RTX毒素家族中的RtxB蛋白便是整合到細(xì)菌內(nèi)膜的ABC結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白。0634編碼一種外膜蛋白，對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行描述時發(fā)現(xiàn)其形成β-桶狀結(jié)構(gòu)，關(guān)于溶血素的研究發(fā)現(xiàn)RTX家族中的rtx毒素蛋白在結(jié)合Ca2+后其C末端結(jié)構(gòu)域在T1SS出口處折疊形成β-桶狀結(jié)構(gòu)[18]，以及在CDC家族中由多個單體組裝成的環(huán)狀孔道前孔復(fù)合物可調(diào)整形成β-桶狀結(jié)構(gòu)[19]。1333注釋為溶血素D，與溶血素轉(zhuǎn)運有關(guān)[20]，且定位于外膜，在厭氧組中高表達(dá)。

表5 部分極顯著差異表達(dá)蛋白的特征

2.9.2基于基因家族主要功能及蛋白結(jié)構(gòu)域的篩選 結(jié)果如表6所示，2109，2214和806的蛋白注釋皆為HlyC/CorC 家族轉(zhuǎn)運子，其蛋白結(jié)構(gòu)域(COD)皆有CBS/Transporter保守結(jié)構(gòu)域，該家族經(jīng)預(yù)測與溶血素的分泌相關(guān)，且有相應(yīng)文獻(xiàn)的報道[21]；而769，0025是HlyD家族蛋白，該家族蛋白與溶血素的轉(zhuǎn)運相關(guān)[22]，1211是SGNH超家族的一類蛋白，注釋為磷脂酶的一部分，故將Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211篩選為假定溶血候選因子。

表6 基于基因家族主要功能及蛋白結(jié)構(gòu)域的篩選

綜上，共篩選到11個假定溶血候選因子，分別為Pm0090，Pm0057，Pm0040，Pm0634，Pm1333，Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一類重要的人獸共患致病菌，可引起多種動物以及人發(fā)病[23]，全世界每年因多殺性巴氏桿菌病而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失在數(shù)百億以上，因此研究多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制仍迫在眉睫。溶血素是一類能使紅細(xì)胞溶解或具有其他細(xì)胞毒性作用的生物學(xué)因子[24]，在原核生物、真核生物中均有發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌溶血素可通過細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞溶解或裂解、離子失衡相關(guān)病變、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等參與細(xì)菌致病過程。

前期我們曾發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下的溶血現(xiàn)象，本研究進(jìn)一步對溶血現(xiàn)象進(jìn)行驗證，證實厭氧條件下不同血清型菌株在動物紅細(xì)胞的不同培養(yǎng)基平板均可引起溶血，這與Hunt等人的試驗結(jié)果基本一致[25]，同時我們猜測在厭氧條件下多殺性巴氏桿菌只要能在相應(yīng)的培養(yǎng)基上生長，最終可能都會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。這表明多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下可能有其特殊的基因表達(dá)模式。研究顯示，液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)胞外分泌的磷脂酶溶血素PLA1的表達(dá)可受到分別位于PLA1基因(plda1)上游50，600 bp處的雙啟動子系統(tǒng)的正調(diào)控，該系統(tǒng)分別調(diào)控該菌在生長對數(shù)期和厭氧條件下PLA1表達(dá)與分泌[26]。多殺性巴氏桿菌PmCQ2(CP033599)中同樣存在磷脂酶A1(plda1)基因(CQ2GL001693 )，該基因是否同樣受到啟動子調(diào)控以及是否與溶血現(xiàn)象有關(guān)，可以作為下一步溶血機(jī)制的研究。

為了探究Pm在厭氧條件下的溶血機(jī)制，本研究用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)從蛋白水平進(jìn)行分析。將多殺性巴氏桿菌厭氧組與有氧組對比，有164個蛋白表達(dá)上調(diào)，282個蛋白表達(dá)下調(diào)。溶血素作為在多種細(xì)菌中存在的毒力因子，我們猜測厭氧條件下溶血表型的出現(xiàn)與多殺性巴氏桿菌溶血相關(guān)因子有密切聯(lián)系，可能與某些蛋白的差異表達(dá)有關(guān)，但其機(jī)制目前還不清楚。因此，篩選假定溶血因子便顯得尤為重要。除參考在其他細(xì)菌現(xiàn)已報道的溶血素，從測得蛋白的注釋、基因家族功能以及本身的功能作用等方面作篩選之外，另一方面也需要從差異蛋白的差異倍數(shù)、注釋、亞細(xì)胞定位等經(jīng)綜合分析后篩選一些未知蛋白。本研究一共篩選了11個假定溶血候選因子，其中Pm2109注釋為HlyC/CorC family transporter，該蛋白不僅表達(dá)上調(diào)且其蛋白結(jié)構(gòu)域由未知結(jié)構(gòu)域(DUF21)、CBS結(jié)構(gòu)域、和轉(zhuǎn)運相關(guān)結(jié)構(gòu)域(transporter)3部分組成，除與鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)溶血素Riean_0415具有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域外[27]，還與嗜水氣單胞菌SSU(AeromonashydrophilaSSU )具有溶血活性的HlyA具有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域，并且與HlyA蛋白序列具有一定的相似性[28]。另外，Pm1211蛋白表達(dá)雖然下調(diào)，其注釋為磷脂酶，功能是脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝，研究顯示細(xì)菌磷脂酶同樣具有溶血功能[29]，但皆需要試驗驗證。當(dāng)然，溶血素除了有可能是蛋白成分外，也有可能是表面活性劑物質(zhì)等，像枯草芽孢桿菌的表面活性素可引起溶血[30]，假單胞菌分泌的鼠李糖脂也可以引起溶血，所以引起巴氏桿菌在厭氧條件下溶血的因素也需要進(jìn)行多角度的考量和探索。

綜上，本研究基于蛋白組學(xué)分析篩選了11個候選溶血因子(Pm0090，Pm0057，Pm0040，Pm0634，Pm1333，Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211)，為多殺性巴氏桿菌溶血機(jī)制研究提供了參考。