高 娜，童劍軍 ，何川川 ，張雪萍 ，楊勇飛 ，李有文*

(1.塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木畜牧科技重點(diǎn)實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

羊痘是由羊痘病毒(capripoxvirus，CaPV)引起的山羊、綿羊的一種急性、熱性接觸性傳染病[1]，臨床表現(xiàn)為體溫升高、鼻炎、皮膚呈紅斑，嚴(yán)重時出現(xiàn)膿瘡和皰疹等癥狀。本病世界各地均有發(fā)生，以非洲北部和中部、印度次大陸和亞洲的部分國家流行尤為嚴(yán)重[2]，我國多省份都有相關(guān)報道。本病為Ⅰ類疫病常呈暴發(fā)性流行，進(jìn)入21世紀(jì)羊痘流行呈上升趨勢，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)及畜產(chǎn)品的國際貿(mào)易，給全球經(jīng)濟(jì)造成重大損失。

羊痘病毒是DNA病毒，基因組長達(dá)到150 kb，呈雙股線形，是唯一在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制DNA病毒[3]。羊痘病毒屬(capripoxvirus)包括綿羊痘病毒(sheeppoxvirus，SPPV)、山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)和皮膚疙瘩病病毒(lumpyskindiseasevirus，LSDV) 3個種，各毒種之間全基因核苷酸序列具有97%的同源性[4]。CaPV基因組含有147個(LSDV有156個)開放閱讀框(ORFs)，分為中間保守區(qū)(024～123ORFs)和兩端側(cè)翼區(qū)(ORFs001～123和ORFs124～147)。側(cè)翼區(qū)主要通過編碼與病毒的毒力或種屬相關(guān)的蛋白來參與病毒的修飾或逃避宿主免疫識別反應(yīng)[5]。其中有3個Kelch-likeprotein(KLP)，分別是019，144和151ORFs(KLP1、KLP2、KLP3)。在進(jìn)化過程中Kelch蛋白結(jié)構(gòu)域十分的保守[6]。多個重復(fù)的Kelch基序所編碼的蛋白稱為Kelch樣蛋白。每個KLP蛋白由3～7個不等的Kelch基序構(gòu)成，每個Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)元件由44～56個氨基酸長度的重復(fù)序列構(gòu)成，里面包含8個高度保守的氨基酸[7]。結(jié)構(gòu)分析證明它是由2個結(jié)構(gòu)域組成無跨膜區(qū)，有2個較明顯的疏水區(qū)。

酵母雙雜交技術(shù)較靈敏簡單快速而被廣泛應(yīng)用于篩選未知的互作蛋白。本試驗制備了羊皮膚組織文庫，首次用酵母雙雜交系統(tǒng)以pGBKT7-KLP1為誘餌蛋白，經(jīng)過對陽性克隆的多重報告基因檢測、DNA測序和回轉(zhuǎn)驗證進(jìn)行了互作蛋白的篩選，以期為進(jìn)一步研究羊痘病毒毒力因子KLP1的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及載體DH5α、PET42b-KLP1載體均由塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室保存；AH109酵母菌株、質(zhì)粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7、pGADT7-T、DsRED-N1PEGFP-N1文庫質(zhì)粒pGADT7-NNJ-cDNA均購自Clontech公司；羊皮組織采自本地養(yǎng)殖戶屠宰的健康綿羊。

1.2 試劑及儀器質(zhì)粒小提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；SfiⅠ酶(Fer-ments公司)；快速凝膠提取和PCR純化組合試劑盒(Thermo，美國)；酵母質(zhì)粒小提試劑盒、酵母雙雜交試劑盒及各種營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(Clontech公司)；Trizol (invitriger公司)；Oligotex mRNA Kits(Qiagen公司)； PEG3350、LiAc、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、智城恒溫培養(yǎng)振蕩器、梯度PCR機(jī)C1000、離心機(jī)、電轉(zhuǎn)化儀、-80℃冰箱等。

1.3 羊皮膚組織酵母cDNA文庫的構(gòu)建羊皮膚組織mRNA的提取:Trizol法提取羊皮膚組織總RNA(根據(jù)說明書操作)，使用Oligotex mRNA Kits試劑盒分離純化樣本mRNA(根據(jù)說明書操作)，最后溶于8 μL的DEPC水中，取1 μL電泳檢測D值。

酵母雙雜交文庫構(gòu)建及質(zhì)量鑒定：用mRNA合成cDNA合成(兩步法)，經(jīng)加5′接頭(3個讀碼框，每個讀碼框連接1份，共3份)均一化處理，cDNA長度分離與載體pGADT7連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞等過程，獲得酵母雙雜交文庫。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取12個單克隆菌落，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。依據(jù)以下公式計算庫容量：CFU / mL= 平板上的克隆數(shù)/10 μL × 100倍×1×103μL，文庫總CFU= CFU/ mL×文庫菌液總體積(mL)

酵母文庫的質(zhì)粒提取與保存：將轉(zhuǎn)化后的原始文庫菌液鋪板，每塊板鋪1萬～2萬個克隆子，37℃過夜培養(yǎng)，第2天用液體培養(yǎng)基洗脫菌株，使用qiagen大抽試劑盒抽提質(zhì)粒。文庫需保存于-80℃冰箱內(nèi)，可保存2年以上，文庫質(zhì)?？梢灾苯佑糜诮湍肝膸旌Y選。

1.4 酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-KLP1的構(gòu)建以PET42b-KLP1質(zhì)粒為模板，用KLP1 的特異性引物(上下游各加入SfiI酶切位點(diǎn),KLP1-F:aaGGCCATTACGGCCatgaagggcaaggaggagaagg;KLP1-R:ccGGCCGAGGCGGCCtcagtagtcctccacccagcca)PCR擴(kuò)增得到KLP1基因后構(gòu)建pGBKT7-KLP1誘餌重組質(zhì)粒，利用SfiⅠ酶作酶切鑒定和測序鑒定。

1.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-KLP1自激活和毒性檢測采用醋酸鋰法將質(zhì)粒pGBKT7-KLP1與pGADT7分別轉(zhuǎn)化到AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行自激活檢測(HIS3、ADE2和LacZ)，同時設(shè)陰陽性對照。HIS3和ADE2的檢測是將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)板在SD-TLHA平板，30℃恒溫培養(yǎng)4 d。LacZ的檢測是從轉(zhuǎn)化平板中挑6個菌落放在濾紙片并將其浸沒放在液氮90 s后取出，室溫放置2 min備用，將濾紙放在盛有顯色液的平皿中，并覆蓋凍溶后的濾紙，30℃黑暗中培養(yǎng)20 min后觀察，2 h后會出現(xiàn)顏色的變化， 4～5 h時記錄結(jié)果并拍照。通過觀察菌落的生長狀態(tài)判斷是否有自激活，同時培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的pGBKT7-KLP1酵母菌并測定其D值。

1.6 酵母雙雜交篩選KLP1蛋白的互作蛋白按酵母雙雜交系統(tǒng)的說明書，將文庫質(zhì)粒pGADT7-WH轉(zhuǎn)入包含對的pGBKT7-KLP1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子受體菌中，制備感受態(tài)后涂SD-TLH平板缺陷平板，30℃培養(yǎng)3～4 d后觀察，進(jìn)行清除影印后挑取陽性菌落。分別用無菌水稀釋上面SD-TLH缺陷型平板中初始結(jié)果為陽性的克隆進(jìn)行ADE2、HIS3、LacZ報告基因檢測。將在SD-TLHA和LacZ檢測均為陽性的克隆提取質(zhì)粒并測序，將測序的結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析，確定候選互作蛋白基因。

1.7 篩選蛋白與KLP1相互作用的驗證如1.3操作，將篩選確定的候選蛋白質(zhì)粒分別與pGBKT7-KLP1誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母菌感受態(tài)，涂布SD-TL平板上，隨機(jī)各挑取6個菌落做LacZ報告基因的激活檢測。

共定位鑒定:將KLP1基因插入DsRED-N1質(zhì)粒，候選蛋白基因插入PEGFP-N1質(zhì)粒，然后將2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到H293細(xì)胞，分別在同一視野下熒光倒置顯微鏡綠色和紅色熒光下拍照，把2張照片放到一起，觀察是否有共定位細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 羊皮組織mRNA的提取分離采用Trizol法提取羊皮組織的總RNA，使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分離純化樣本的mRNA電泳檢測，結(jié)果為總RNA呈清晰的3個條帶，mRNA呈彌散條帶，主要集中在1 000 bp左右(圖1)。

A.總RNA基因組電泳結(jié)果；B.mRNA基因組電泳結(jié)果；M.DNA Marker 5 000;1,2,3.羊皮組織樣本mRNA

2.2 羊皮酵母cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)量鑒定用mRNA合成cDNA合成，經(jīng)加5′接頭法與庫載體pGAKT7連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到酵母雙雜交文庫。依據(jù)庫容量計量公式算提庫容量為1.05×107CFU。通過PCR擴(kuò)增，電泳檢測其產(chǎn)物大小(圖2)，插入的片段平均長度約為1 000 bp，文庫的陽性率為100%。

M.DNA Marker 5 000;1～12.為羊皮膚組織酵母文庫cDNA插入片段電泳結(jié)果

2.3 酵母文庫質(zhì)粒提取及文庫保存將酵母文庫菌液按每塊板1萬～2萬個克隆子鋪于35 cm的平板，培養(yǎng)洗脫后用qiagen大抽試劑盒抽提質(zhì)粒，共提取得到210 μg去內(nèi)毒素的高質(zhì)量文庫質(zhì)粒(圖3)，文庫保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

圖3 酵母文庫在平板上生長

2.4 酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7- KLP1的構(gòu)建按照分子克隆的方法構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒PGBKT7-KLP1酶切鑒定結(jié)果見圖4，后經(jīng)測序結(jié)果顯示載體構(gòu)建正確，讀碼框正確。

M.DL5000 DNA Marker;1～3.為誘餌質(zhì)粒PGBKT7-KLP1酶切電泳結(jié)果

2.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-KLP1自激活與毒性檢測對誘餌質(zhì)粒pGBKT7-KLP1與pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，分別經(jīng)報告基因HIS3、ADE2和LacZ檢驗，與陰陽性對照試驗，結(jié)果說明KLP1沒有自激活作用(圖5)，培養(yǎng)試驗測定含pGBKT7-KLP1的酵母菌D值0.87，對酵母也沒有毒性，可用于篩選互作蛋白。

pGBKT7-p53/pGADT7-largeT為陽性對照；pGBKT7-laminC/pGADT7-largeT為陰性對照

2.6 KLP1與宿主細(xì)胞互作蛋白的篩選將文庫質(zhì)粒pGADT7-WH轉(zhuǎn)入含有正確pGBKT7-KLP1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母備感受態(tài)，經(jīng)SD-TL和SD-TLHA兩種營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)得到19個候選克隆和LacZ報告基因檢測，最終有11個通過檢測(圖6)。對19個候選克隆測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析，最終確定notch 1，protein phosphatase 4， transcript variant X3等9個蛋白作為KLP1互作的候選蛋白。

1～25分別是篩庫得到的25個初始陽性克隆;“+”為陽性對照;“-”為陰性對照

2.7 篩選蛋白與KLP1相互作用的LacZ回轉(zhuǎn)驗證用以上測序確定的9種候選蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含pGBKT7-KLP1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母菌感受態(tài)，進(jìn)行LacZ回轉(zhuǎn)試驗。結(jié)果顯示，5個陽性克隆與誘餌克隆的回轉(zhuǎn)驗證對LacZ報告基因有激活作用(圖7)。

2，5，8，9和10號對LacZ報告基因有激活作用

2.8 篩選蛋白與KLP1相互作用的共定位驗證將兩張照片重疊合并后(merge)，結(jié)果可見Notch1與KLP1在同一個細(xì)胞中進(jìn)行了共定位，說明其具有互相作用的可能(圖8)。

A.為PEGFP-Notch1;B.為DsRED-KLP1;C.AB組合共定位

3 討論

蛋白質(zhì)間的相互作用在生命活動中扮演著重要角色。酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)、pull-down、熒光共定位等都可以研究蛋白質(zhì)的相互作用[8]。其中酵母雙雜交方法具有快速、適用性廣泛、高敏感性的特點(diǎn)，本試驗為構(gòu)建高質(zhì)量的羊皮膚組織cDNA文庫，需選取新鮮的羊皮膚組織作為樣品，分離和純化樣本mRNA期間要防止RNase酶污染。cDNA合成過程中第1鏈需要嚴(yán)格控制了各個階段反應(yīng)的溫度，保證酶的最佳活性。cDNA片段通過采用公司酵母菌經(jīng)典的醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率很高，cDNA文庫容量為1.05×107CFU，去內(nèi)毒素的高質(zhì)量文庫質(zhì)粒為210 μg，達(dá)到酵母雙雜交技術(shù)互作蛋白的篩選要求。該系統(tǒng)多采用報告基因，本研究所選用的ADE2、HIS3、lacZ能夠消除由于融合蛋白直接與GAL4結(jié)合位點(diǎn)或接近結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生的假陽性，同時也消除了融合蛋白結(jié)和到一個轉(zhuǎn)錄因子再結(jié)合到特定的TATA盒子所產(chǎn)生的假陽性[9]。但是該報告基因篩選出的是誘餌蛋白和序列片段之間的相互作用而不是完整的蛋白，因此也會出現(xiàn)假陽性還需雙分子熒光互補(bǔ)等方法驗證，如本試驗測序后篩選出與KLP1互作的有9種蛋白但通過報告基因檢測和共定位驗證的只有1種。

本試驗利用酵母雙雜交技術(shù)從羊皮膚組織cDNA文庫中篩選出與KLP1蛋白相互作用的9種蛋白，通過查閱這9種蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)，初步了解了其功能作用，經(jīng)過LacZ回轉(zhuǎn)驗證和共定位試驗驗證，發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白與KLP1蛋白具有特異的相互作用。Kelch蛋白家族種類眾多生物功能廣泛，不僅參與提供重要的信號傳導(dǎo)途徑，還可調(diào)控細(xì)胞周期以及腫瘤的發(fā)生，介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，參與蛋白質(zhì)的降解[10]。BALINSKY 等[11]有研究發(fā)現(xiàn)綿羊痘病毒缺失ORF019的KLP基因后病毒毒力會大幅度下降，這表明KLP1是羊痘病毒十分重要的毒力因子，而Notch1作為Notch信號通路的單次跨膜受體蛋白，可以參與免疫應(yīng)答調(diào)控、決定抗原呈遞能力和細(xì)胞毒性的基因，與病毒的感染有關(guān)。AUDERCT等[12]表明小鼠的Notch1基因缺失后會抑制Th1細(xì)胞的分化從而更容易感染利士曼原蟲。謝金玲[13]也發(fā)現(xiàn)機(jī)體感染幽門螺桿菌后Notch1的表達(dá)水平高。因此我們推測Notch1信號通路與山羊痘毒力因子KLP1感染機(jī)體后疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前尚未見這2個蛋白相互作用機(jī)制的報道，通過本試驗希望能為GTPV中KLP1互作蛋白的研究提供理論依據(jù)。