杜東穎，黃曉靜，劉武杰，段佳蕾，盛東北，田 輝，王孟月，姚延丹，張盼濤*，田克恭*

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000;2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000)

雞的禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)感染在世界上許多國家均有報道，其中尤以禽腺病毒(C種，4型)(FAdV-4)的危害最為嚴(yán)重，臨床表現(xiàn)為“心包積液-肝炎綜合征”。近幾年來，該病在我國華中、華東等地區(qū)廣泛流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病可通過水平和垂直兩種途徑傳播，黃羽肉雞、白羽肉雞、蛋雞、種雞等均可感染發(fā)病[1-2]。

研究證實FAdV-4基因組含2個Fiber閱讀框，分別編碼Fiber-1和Fiber-2蛋白，其中Fiber-2蛋白在病毒的入侵、增殖、組裝和釋放過程中發(fā)揮重要作用[3]，同時該蛋白可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)[4]。Ⅰ群禽腺病毒根據(jù)血清學(xué)關(guān)系、體外培養(yǎng)特征和核酸特性分為A～E 5個種和12個血清型[5-6]，Ⅰ群禽腺病毒12個血清型之間交叉保護性較差，因此在防控上必須選用與流行株匹配的免疫原或抗體才能有效遏制疫情的蔓延[7-8]。目前國內(nèi)市場上尚無商品化的免疫原或抗體，常見的抗病毒和抗菌藥物防治Ⅰ群禽腺病毒感染的效果不佳，且耐過雞發(fā)育受阻，嚴(yán)重影響經(jīng)濟效益[9]。

卵黃抗體接種是一種有效的防控手段，在動物疫病防控中發(fā)揮重要作用。但以雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)病毒的方式生產(chǎn)抗原，存在著生產(chǎn)成本高、病毒滴度低的問題，滅活免疫原免疫蛋雞后血清抗體滴度較低，制備的卵黃抗體效價偏低，預(yù)防效果不佳。因此，急需開發(fā)出成本可控、預(yù)防效果良好的卵黃抗體來有效防控Ⅰ群禽腺病毒感染。本研究首次采用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備的抗原蛋白Fiber-2免疫蛋雞制備卵黃抗體，并對其防治效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒種C種4型禽腺病毒FAV-HN株均由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ酶、T4 DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司；C種4型禽腺病毒AGP抗原和陽性血清(AGP效價為1∶16)均由本實驗室制備并保存；禽腺病毒Ⅰ群(FADV-I)抗體ELISA試劑盒購自荷蘭BioChek；層析介質(zhì)Ni Sepharose 6 Fast Flow購自General Electric Company；白油購自北京華美潤；吐溫-80及司本-80均購自廣東超能；甲醛等分析純購自國藥集團。

1.3 實驗動物SPF雞由購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司的種蛋自行孵化、飼養(yǎng)至所需日齡；140～160日齡海蘭褐蛋雞購自洛陽周邊某雞場，該雞群無Ⅰ群禽腺病毒感染和相關(guān)免疫原免疫史，本次試驗使用的蛋雞經(jīng)禽腺病毒Ⅰ群(FADV-I)抗體ELISA試劑盒檢測為陰性。

1.4 Fiber-2蛋白表達與純化參考GenBank上公布的Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白基因序列(FR872912.1)，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計擴增Fiber-2基因的引物，上游引物Fiber-2 F：5′-GGGAATTCCATATGATGCTCCGAGCCCCTAAA-3′(下劃線序列為NdeⅠ)；下游引物Fiber-2 R：5′-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCTGCTG-3′(下劃線序列HindⅢ)。以提取的病毒液DNA為模板進行Fiber-2基因的擴增，pET-28a載體和Fiber-2基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切后，利用T4 DNA連接酶進行連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a-FAdV-Fiber-2。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素的質(zhì)量濃度為50 mg/L)，37℃培養(yǎng)過夜；將菌液按照1∶100的體積比加至LB液體培養(yǎng)基中；37℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌液D600值達0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h；對誘導(dǎo)后的菌體進行超聲裂解，離心取上清利用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow鎳柱層析純化，收集洗脫蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，PBS透析后過濾除菌，并利用Ⅰ群4型禽腺病毒陽性血清進行瓊脂擴散試驗，測定Fiber-2蛋白液的AGP效價。

1.5 免疫原制備及檢驗取AGP效價不低于1∶32的Fiber-2蛋白液，按照水相與油相1∶2的比例制備C種4型禽腺病毒免疫原，按現(xiàn)行的《中國獸藥典》附錄對其進行性狀檢驗、無菌檢驗及安全性檢驗。

1.6 免疫產(chǎn)蛋雞將制備的免疫原通過肌肉注射140～160日齡商品蛋雞，1.0 mL/只，首免后21 d以相同方法和劑量進行加強免疫；二免后14 d以相同方法和劑量進行第3次免疫；三免后，每隔10 d抽樣檢測雞蛋蛋黃中C種4型禽腺病毒AGP抗體效價，效價不低于1∶64時收集高免蛋，置2～8℃貯存。

1.7 精制卵黃抗體的制備將高免蛋進行消毒和噴霧熏蒸，采取手工或機械打蛋，充分除去蛋清、胎盤和系帶，收集蛋黃。充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加入等體積滅菌并冷卻的蒸餾水62.5℃滅活30 min。向滅活后的蛋黃液中加入相當(dāng)于原蛋黃7倍體積的滅菌蒸餾水(pH 4.2)中，并降溫至2～8℃，邊加邊攪拌，2～8℃靜置4 h；14 000 r/min離心取上清，并向上清中加入終濃度為0.2%的辛酸，攪拌均勻，室溫放置2～4 h后進行粗濾，取上述濾液加入終濃度為0.1%的甲醛溶液37℃滅活12 h，制得精制卵黃抗體，測定精制卵黃抗體的AGP效價。

1.8 抗體防治效果評價

1.8.1感染前注射抗體的防治效果 50只SPF雞隨機分為5組，10只/組，其中4組分別于35,37,39和41日齡肌肉注射精制卵黃抗體，另1組于41日齡皮下注射精制卵黃抗體，注射劑量均為1 mL/只。上述5組注射抗體的SPF雞于42日齡時腿部肌肉注射C種4型禽腺病毒FAV-HN株，0.5 mL/只(含106.0TCID50)。同時設(shè)置10只相同日齡的SPF雞作為對照，僅感染病毒，不注射抗體。感染后連續(xù)觀察14 d，記錄各組SPF雞的發(fā)病癥狀和死亡剖檢變化，評價精制卵黃抗體的防治效果。

1.8.2感染后注射抗體的防治效果 42日齡SPF雞40只隨機分為4組，10只/組，腿部肌肉注射C種4型禽腺病毒FAV-HN株，0.5 mL/只(含106.0TCID50)。感染后24 h，其中2組分別通過皮下和肌肉途徑注射精制卵黃抗體1 mL/只，另外2組分別通過皮下和肌肉途徑注射精制卵黃抗體2 mL/只。同時設(shè)置1組(10只)同日齡SPF雞為對照組，僅感染病毒，不注射抗體。感染后連續(xù)觀察14 d，分別根據(jù)各組SPF雞的臨床發(fā)病癥狀和死亡剖檢病變情況對精制卵黃抗體的緊急預(yù)防效果進行評價。

2 結(jié)果

2.1 Fiber-2蛋白表達與純化利用Ni Sepharose 6 Fast Flow對大腸桿菌表達的Fiber-2蛋白進行親和層析純化，將純化后的蛋白同時經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測及Western blot分析，在55～70 kDa可見到明顯目的條帶，蛋白純度可達90%以上，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)瓊脂擴散試驗測定純化后蛋白的AGP效價為1∶64。

M.預(yù)染蛋白Marker;1.純化后的Fiber-2蛋白

2.2 免疫原檢驗對制備的C種4型禽腺病毒亞單位免疫原進行性狀檢驗、無菌檢驗及安全性檢驗。性狀檢驗結(jié)果顯示，免疫原為油包水型的乳白色均勻乳劑，取10 mL免疫原以3 000 r/min離心15 min，無水相析出，穩(wěn)定性良好。無菌檢驗結(jié)果表明免疫原無細(xì)菌、霉菌等污染。用14日齡SPF雞10只，頸部皮下注射免疫原1.0 mL，觀察14 d，SPF雞未出現(xiàn)由免疫原引起的任何局部和全身不良反應(yīng)，表明制備的亞單位免疫原安全性良好。

2.3 精制卵黃抗體AGP效價測定Fiber-2蛋白亞單位免疫原3次免疫商品蛋雞，蛋黃中C種4型禽腺病毒AGP抗體效價不低于1∶64時收集雞蛋，按照現(xiàn)有工藝提純制備精制卵黃抗體，測定制備的精制卵黃抗體的AGP效價為1∶8。

2.4 感染前注射抗體的防治效果

2.4.1臨床癥狀 卵黃抗體預(yù)防組和感染對照組SPF雞感染后連續(xù)觀察14 d，感染對照組的10只雞均于感染后3～4 d表現(xiàn)出精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動、閉眼嗜睡等臨床癥狀，臨床癥狀出現(xiàn)后1～2 d 7只發(fā)病雞死亡；而各卵黃抗體預(yù)防組SPF雞攻毒后14 d內(nèi)均正常，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

2.4.2剖檢結(jié)果 感染對照組死亡SPF雞剖檢可見心包積液及肝臟腫大、出血等C種4型禽腺病毒感染的典型病變。各卵黃抗體預(yù)防組攻毒后14 d剖檢，各臟器均無異常。

該評價結(jié)果表明，制備的精制卵黃抗體的預(yù)防效果良好，肌肉和皮下途徑1 mL/只的注射劑量即可提供不低于7 d的攻毒保護。具體結(jié)果如表1所示。

表1 C種 4型禽腺病毒精制卵黃抗體于感染前注射的防治結(jié)果

2.5 感染后注射抗體的緊急防治效果

2.5.1臨床癥狀 卵黃抗體預(yù)防組和感染對照組SPF雞感染后連續(xù)觀察14 d，感染對照組的10只雞均于感染后3～4 d出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動、閉眼嗜睡等臨床癥狀，臨床癥狀出現(xiàn)后1～2 d其中6只發(fā)病雞死亡；而各卵黃抗體預(yù)防組SPF雞攻毒后，僅1.0 mL/只經(jīng)皮下注射組的1只SPF雞于攻毒后3～5 d出現(xiàn)羽毛蓬亂、不愿走動等臨床癥狀，其余組SPF雞攻毒后14 d內(nèi)均正常，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

2.5.2剖檢結(jié)果 感染對照組的10只死亡雞剖檢可見心包積液及肝臟腫大、出血等C種4型禽腺病毒感染的典型病變。各卵黃抗體預(yù)防組于攻毒后第14日剖檢，各臟器均無異常。

該試驗結(jié)果表明，SPF雞感染病毒24 h后，制備的精制卵黃抗體以不低于1.0 mL/只的劑量經(jīng)皮下或肌肉注射SPF雞，可以對C種4型禽腺病毒強毒株的攻擊提供90%～100%的保護，卵黃抗體的緊急預(yù)防效果良好。結(jié)果如表2所示。

表2 感染后注射C種4型禽腺病毒卵黃抗體的緊急防治結(jié)果

3 討論

禽腺病毒是全球家禽和野禽常見的傳染病病原[10]。多數(shù)禽腺病毒可在健康禽體內(nèi)復(fù)制，癥狀非常輕微或不表現(xiàn)感染癥狀；在混合感染時，禽腺病毒可成為條件性病原，禽腺病毒作為原發(fā)病原，可引起火雞出血性腸炎，鵪鶉支氣管炎和產(chǎn)蛋下降綜合征等[11]。禽腺病毒分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞群，Ⅱ、Ⅲ亞群分別可引起火雞出血性腸炎和產(chǎn)蛋下降綜合征[12]，Ⅰ群禽腺病毒分為A～E 5個種和12個血清型[13]。大多數(shù)Ⅰ群腺病毒的致病性還未完全明確，不同血清型的致病性有較大差異[14]。Ⅰ群禽腺病毒的Fiber-2蛋白在介導(dǎo)禽腺病毒感染及致病中具有重要作用，且能有效刺激機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，是制備亞單位免疫原合適的免疫原[15-16]。

近幾年來，由C種4型禽腺病毒引起的“心包積液-肝炎綜合征”給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一[17-21]。目前該病的藥物預(yù)防效果不佳，通過注射高免卵黃抗體進行預(yù)防成為目前防控C種4型禽腺病毒流行較為理想的有效手段，高免卵黃抗體已廣泛應(yīng)用于多種疾病的防治，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉，臨床應(yīng)用效果良好[22-24]。因此，C種4型禽腺病毒精制卵黃抗體的研究具有重要意義。

目前已知的C種4型禽腺病毒精制卵黃抗體制備的免疫原多為雞胚毒、組織毒或細(xì)胞毒，制備的抗原含量較低，成分復(fù)雜，且存在著滅活不完全造成散毒的生物安全風(fēng)險。亞單位免疫原具備免疫原性良好、安全性高的優(yōu)點，因此以Fiber-2蛋白研制亞單位免疫原進行卵黃抗體的制備具有良好的應(yīng)用效果和前景。

本研究通過對C種4型禽腺病毒Fiber-2蛋白進行表達與純化，獲得蛋白純度及AGP效價較高的Fiber-2蛋白液，進一步制備抗原含量高且安全有效的C種4型禽腺病毒亞單位免疫原，免疫產(chǎn)蛋雞，并通過卵黃抗體提純制備C種4型禽腺病毒精制卵黃抗體。通過常規(guī)預(yù)防和緊急預(yù)防2種方式評價制備的卵黃抗體的應(yīng)用效果，研究結(jié)果顯示，制備的精制卵黃抗體以1.0 mL/只的免疫劑量，采用肌肉或皮下的注射方式在免疫后至少7 d內(nèi)均能完全保護SPF雞免受C種4型禽腺病毒強毒株的攻擊；且SPF雞在感染病毒后24 h內(nèi)，以不低于1.0 mL/只的免疫劑量進行緊急預(yù)防，可為SPF雞提供90%～100%的保護，免疫效果切實有效。本研究為禽腺病毒病的臨床防控提供了安全、快速有效的技術(shù)手段，且為后續(xù)精制卵黃抗體的應(yīng)用研究及規(guī)模化生產(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)。