孔令昊，苗信永，趙士杰，李 聞，徐朋麗，孫楊揚(yáng)，崔志瑩，夏平安*，張宜娜*，吳 斌

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430070)

豬偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種豬急性、多種動(dòng)物共患的接觸性傳染病，主要臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢(豬除外)、神經(jīng)癥狀；母豬出現(xiàn)不孕、流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、腹瀉，最終引起死亡，死亡率高達(dá)100%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。PRV只有1個(gè)血清型，但是不同毒株之間的毒力差異很大，其原因是毒力由多個(gè)基因控制[2]。PRV基因組全長(zhǎng)約150 kb，GC含量高達(dá)73%。目前已經(jīng)測(cè)定功能的PRV的糖蛋白主要有11種：gB(UL27)、gC(UL44)、gD(US6)、gE(US8)、gG(US4)、gH(UL22)、gK(UL53)、gI、gL(UL1)、gM、gN(UL49.5)。在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中，糖基化蛋白gB、gC、gD、gH和gL負(fù)責(zé)病毒附著于宿主細(xì)胞的表面和病毒的囊膜與細(xì)胞膜的融合。糖基化蛋白作為病毒粒子和被感染細(xì)胞的表面組成部分，是宿主免疫的主要靶標(biāo)。其中g(shù)C糖蛋白可以與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素受體結(jié)合[3]，而且能夠激起宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫，是重要的中和抗原，也是亞單位疫苗的首選抗原之一[4-5]。gE糖蛋白屬于囊膜蛋白，該蛋白可以顯著影響病毒的毒力，與gI糖蛋白以非共價(jià)鍵的形式存在于感染細(xì)胞表面[6-7]，在促進(jìn)細(xì)胞間的融合，介導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間的擴(kuò)散以及病毒粒子的釋放都發(fā)揮著巨大的作用。1947年在貓?bào)w內(nèi)分離出PRV，證明我國存在該病毒[8]，之后PRV在我國的報(bào)道越來越多。在20世紀(jì)70年代，我國引入Bartha-K61株疫苗后，我國的PRV得到了有效地控制[9]，但在2011年末，我國使用PRV基因缺失苗免疫大部分地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)大量疑似PRV病例，后續(xù)研究表明此次PR的暴發(fā)是由PRV變異毒株引起[10]。本研究通過雙重PCR技術(shù)對(duì)河南省部分養(yǎng)豬場(chǎng)的PR流行情況進(jìn)行調(diào)查，以及gC、gE遺傳進(jìn)化及序列分析比對(duì)，以期分析闡明我省不同地區(qū)PRV流行株的分子特征，為PRV的分子流行病學(xué)調(diào)查及病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及病料樣品來源膠回收試劑盒、柱式DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DH-5α感受態(tài)細(xì)胞及質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；此次試驗(yàn)所用的2018-2020年期間河南省7個(gè)地區(qū)的307份病料樣品由實(shí)驗(yàn)室保存及現(xiàn)場(chǎng)采集(表1)。

表1 河南省7個(gè)地區(qū)疑似病料來源信息

1.2 PRV的雙重PCR檢測(cè)參照GenBank收錄的gB、gE全基因序列設(shè)計(jì)了2對(duì)檢測(cè)引物P1/P2和P3/P4(引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度如表2)。按照病毒DNA抽提試劑盒提取說明書提取組織DNA，建立雙重PCR檢測(cè)方法檢測(cè)上述DNA。優(yōu)化后反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 1 min、56℃ 1 min、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

1.3 PRVgC/gE全基因組的克隆及測(cè)序參照GenBank收錄的PRV全基因序列設(shè)計(jì)了PRV-gC/gE全基因引物P5/P6和P7/P8(引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度如表2)。按照1.2的方法提取病毒DNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；98℃ 30 s、58℃ 30 s、68℃ 100 s，35個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min。純化回收PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體中，將重組的質(zhì)粒送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.4 PRVgC/gE全基因序列分析利用DNAStar軟件對(duì)克隆的PRV-gC/gE基因序列和GenBank中選取的PRV代表株基因序列進(jìn)行比較與分析。用MEGA 7.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建，采用Neighbor-Joining法，bootstrap值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果

2.1 PRV-gC/gE全基因克隆結(jié)果分析使用表2的PRV-gC/gE全基因引物(P5/P6和P7/P8)對(duì)14株P(guān)RV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出1 791,1 862 bp的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一致(圖1,2)，測(cè)序結(jié)果表明已經(jīng)成功克隆出PRV-gC/gE全基因。

M.DL2000 DNA Marker；+.陽性對(duì)照；-.陰性對(duì)照；1～14.樣品

M.DL2000 DNA Marker；1～14.樣品；-.陰性對(duì)照

2.2 病毒分離株gC全基因序列遺傳進(jìn)化分析對(duì)分離得到的14株P(guān)RV以及25株來自國內(nèi)外不同年代的PRV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明所有的PRV基因型分為2種：Group 1型主要為亞洲毒株；而Group 2型主要為歐洲和美洲毒株，也包括部分我國的HLJ-2013、NIA-2013毒株、19世紀(jì)90年代YamagataS-81日本毒株和19世紀(jì)90年代韓國分離測(cè)序的NYJ-1987毒株。Group1型還可以進(jìn)一步分為3種基因亞型，以HN-2012毒株為代表的變異毒株組成了基因亞型Group 1.1；以Ea-1995毒株為代表的經(jīng)典毒株組成了基因亞型Group 1.2；以Fa-1993毒株和馬來西亞毒株P(guān)-Prv毒株組成了基因亞型Group 1.3。本研究分離得到的14株P(guān)RV中都位于基因亞型Group1.1(圖3)。核苷酸序列分析結(jié)果表明，所分離的14株P(guān)RV之間的同源性為99.6%～100.0%，與國內(nèi)變異毒株HeN1-2012、AnH1-2015、HB1201、DJY-2020同源性為99.8%～100.0%，與Ea-1995國內(nèi)經(jīng)典株的同源性為99.5%～99.7%，與馬來西亞P-Prv-Budr7同源性為98.8%～99.0%；與國外經(jīng)典毒株Bartha毒株同源性為94.7%～95.8%。其中國內(nèi)4株變異毒株HN-2012、AnH1-2015、HB1201、DJY-2020的同源性為100%。氨基酸序列對(duì)比分析表明，與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea等毒株只有3處變異：N34T、K99E、E194G；與國內(nèi)變異代表HN-2012毒株相比沒有氨基酸變異或缺失；與國外經(jīng)典毒株Bartha等經(jīng)典毒株相比，本研究測(cè)序14株P(guān)RV均存在第63氨基酸位點(diǎn)處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸(AAASTPA)，并且gC全基因序列中存在30處氨基酸的替換。

注：▼為本研究分離的PRV。下同

2.3 病毒分離株gE全基因序列遺傳進(jìn)化分析為研究本研究測(cè)序的14株P(guān)RV的gE基因主要功能區(qū)的變異情況，與不同年代國內(nèi)外分離的24株P(guān)RV的gE基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析及氨基酸序列對(duì)比分析。結(jié)果表明，所有PRV毒株表現(xiàn)2種基因型：Group1型也是主要為亞洲毒株，包括馬來西亞的P-Prv-2008毒株；而Group 2型主要為歐洲和美洲毒株。Group 1型亞洲毒株又可以分為2種基因亞型，Group 1.1由HeN1-2012株為代表的變異毒株以及韓國YangSan-2003毒株組成，Group 1.2是以Ea-China、HUBEI-2016、GuangDong-2008等經(jīng)典毒株以及馬來西亞的P-Prv-2008毒株組成(圖4)。本研究測(cè)序的14株P(guān)RV核苷酸序列分析結(jié)果表明，14株P(guān)RV之間核苷酸序列同源性為98.7%～100.0%，HN-619與另外13株P(guān)RV毒株同源性為98.7%～99.0%，其余13株為99.5%～100.0%；與國內(nèi)變異毒株HeN1-2012、ANHUI2-2018同源性為98.7%～99.9%；與國外經(jīng)典毒株Kaplan同源性為96.6%～97.7%。氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明：本研究的14株豬偽狂犬病毒中J32、J33 2株P(guān)RV毒株中在第169氨基酸位點(diǎn)處均存在4個(gè)氨基酸(DLNG)的連續(xù)缺失，且HN-619毒株在第823位氨基酸位點(diǎn)處存在(CL)2位氨基酸連續(xù)缺失。與國內(nèi)經(jīng)典毒株HeN1-2012、ANHUI2-2018相比本研究的14株P(guān)RV毒株存在自6處氨基酸突變：G54D、P403A、V450I、496D(插入)、G510S、S518P。與國外經(jīng)典毒株Kaplan相比，本研究分離得到的14株P(guān)RV毒株存在23處氨基酸變異位點(diǎn)：48D(插入)、D54G、D63N、L106V、S122A、M149R、S179T、L181Q、A215L、D216A、A447G、I448V、R471G、H473R、496D(插入)、I502A、A507S、S510G、A520V、P524A、N751S、M575N、S576A。

圖4 PRV-gE遺傳進(jìn)化樹

3 討論

PR是危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要的傳染病之一，給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬PR主要引起母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、尤其死胎最為嚴(yán)重[11]。研究表明，豬不僅是原發(fā)感染宿主，也是長(zhǎng)期的病毒攜帶者和排毒者，對(duì)于病毒的傳播起到了至關(guān)重要的作用[12]。Bartha-K61株基因缺失疫苗是目前市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的基因缺失疫苗[13]。陳煥春等[14]研制出全病毒油乳滅活疫苗，又有人研制出基因缺失疫苗，為我國的PRV防控做出了突出的貢獻(xiàn)[15-17]。然而在2011年，我國不同省份的多個(gè)豬場(chǎng)依然出現(xiàn)了PRV暴發(fā)的情況，主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)和仔豬高死亡率，許多豬場(chǎng)的新生仔豬的死亡率高達(dá)100%，后續(xù)研究證明此次暴發(fā)為PRV變異毒株引起[18]。為掌握我省的偽狂犬當(dāng)前的流行情況以及遺傳關(guān)系，本研究對(duì)2018-2020年河南省部分地區(qū)的307份病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出14株P(guān)RV陽性病料，測(cè)序并進(jìn)行遺傳進(jìn)化及序列對(duì)比分析。分析結(jié)果表明，本研究所分離的14株P(guān)RV之間gC、gE全基因核苷酸序列同源性為99.6%～100.0%和98.7%～100.0%，與國內(nèi)變異毒株HeN1-2012核苷酸序列同源性為99.8%～100.0% 和98.7%～99.9%，與國外經(jīng)典毒株的核苷酸序列同源性為94.7%～95.8%和96.6%～97.7%。結(jié)果顯示，PRV與變異毒株HeN1-2012等屬于同一基因亞型，且親緣關(guān)系最為接近，與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea等株屬同一分支，可以推測(cè)均來自國內(nèi)最早的流行株，與國外經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

本研究所測(cè)序的14株P(guān)RV在gC、gE蛋白氨基酸序列上均存在特征性變異位點(diǎn)。gC蛋白質(zhì)是豬體免疫應(yīng)答的主要靶目標(biāo)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4]，本研究測(cè)序的14株P(guān)RV與HeN1-2012等變異毒株的gC氨基酸序列相比，沒有明顯的變異，且與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea等的gC氨基酸序列相比只有3處變異：N34T、K99E、E194G。資料顯示，病毒中和抗體的結(jié)合位點(diǎn)位于N端的65～99位氨基酸，且該區(qū)域存在2個(gè)肝素結(jié)合區(qū)域(76～81位、96～100位)，特別是第1個(gè)位點(diǎn)，是介導(dǎo)體液免疫的潛在位點(diǎn)[19]，在上述區(qū)域中，只有第99位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?與國外經(jīng)典毒株Bartha、Kaplan等經(jīng)典毒株相比，本試驗(yàn)所測(cè)序的14株P(guān)RV的gC氨基酸序列上均存在第63位氨基酸位點(diǎn)處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸(AAASTPA)，并且存在30處氨基酸的替換，至于這些氨基酸的缺失/插入及突變對(duì)毒力的影響，還有待進(jìn)一步研究。gE基因是PRV主要的毒力基因，該基因編碼病毒的囊膜糖蛋白質(zhì)，對(duì)病毒神經(jīng)嗜性及神經(jīng)毒性有重要影響[6]。其中，第125位的V和第126位的C被認(rèn)為是決定病毒毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)，缺失這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)病毒毒力的影響與缺失整個(gè)gE蛋白質(zhì)無異[20]。本研究測(cè)序的14株P(guān)RV與HeN1-2012等變異毒株的gE蛋白氨基酸序列相比，J32、J33 2株P(guān)RV毒株中在169氨基酸位點(diǎn)處均存在4個(gè)氨基酸(DLNG)的連續(xù)缺失。且HN-619毒株在第823位氨基酸位點(diǎn)處存在(CL)2位氨基酸連續(xù)缺失；gE蛋白質(zhì)共有6個(gè)抗原表位區(qū)，其中5個(gè)位于N端胞外區(qū)的52～238位氨基酸[20]。已有研究表明，感染PRV后，豬體內(nèi)產(chǎn)生的抗體大多數(shù)是針對(duì)E抗原表位區(qū)[21]。與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea等毒株相比，本研究測(cè)序的14株P(guān)RV毒株在gE氨基酸序列上存在6處氨基酸突變：G54D、P403A、V448I、497D(插入)、G510S、S518P，第448位氨基酸(V448I)的一致變異，但是對(duì)gE蛋白抗原表位并未產(chǎn)生影響[22]，其中第54位氨基酸處于JACOBS等[20]預(yù)測(cè)的抗原表位區(qū)中，對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能影響不大，但是該位點(diǎn)甘氨酸突變?yōu)樘於彼岷偷?97位天冬氨酸的插入，特別是第497位天冬氨酸的插入，可作為鑒定PRV變異株的分子特征，與遇秀玲等[10]和趙鴻遠(yuǎn)等[23]分離PRV毒株，在gE蛋白這2個(gè)位點(diǎn)附近也存在天冬氨酸的突變和插入的表述一致。與國外經(jīng)典毒株Bartha、Kaplan等經(jīng)典毒株相比，在gE蛋白氨基酸序列上，存在23處氨基酸變異位點(diǎn)。本試驗(yàn)的14株P(guān)RV中，HN-JZ45病毒拷貝數(shù)較其他毒株最高，在氨基酸序列分析中，只有第286，309位氨基酸變異；至于這些缺失/插入及突變對(duì)各毒力蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，還有待進(jìn)一步研究。通過與國內(nèi)流行變異毒株和國內(nèi)外經(jīng)典毒株氨基酸序列分析表明，PRV在gC、gE都有不同程度的氨基酸位點(diǎn)變異情況，這也能從分子水平上說明經(jīng)典毒株的疫苗在臨床上不能對(duì)豬群提供完全的免疫保護(hù)提供了參考。

同時(shí)本研究分離得到的14株P(guān)RV毒株分別來自河南省不同地區(qū)的不同豬場(chǎng),PRV-gC全基因分析也能推測(cè)出河南省的PRV在gC、gE全蛋白氨基酸序列整體變異程度較小，也能為河南省在PRV的防控上提供理論基礎(chǔ)。