本規(guī)范適用于非洲豬瘟病毒流行毒株與非洲豬瘟病毒CD2v 和MGF 360-505R 基因缺失株的熒光PCR方法鑒別檢測。

1 主要試劑

1.1 核酸提取試劑盒。

1.2 無核酸酶水。

1.3 熒光PCR預(yù)混液（2×）。

1.4 引物和探針：P72、CD2v、MGF360-505R 基因擴增引物和探針由國家非洲豬瘟參考實驗室設(shè)計并提供（聯(lián)系人：李林，電話：0532-87839188）。

1.5 陽性和陰性對照：陽性對照樣品為ASFV 基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（用無核酸酶水稀釋1 000 倍后使用），由國家非洲豬瘟參考實驗室提供；陰性對照樣品為無核酸酶水。

2 主要儀器設(shè)備

2.1 熒光PCR擴增儀。

2.2 臺式低溫高速離心機。

2.3 組織勻漿機。

2.4 微量可調(diào)移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL等不同規(guī)格）。

2.5 無核酸酶離心管與吸頭。

2.6 PCR擴增管。

3 樣品采集和運輸保存

對活豬，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；對病死豬或已屠宰豬，可采集脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟等組織。盡快送至實驗室進行病毒核酸檢測。

樣品的運送與保存應(yīng)滿足NY/T 541《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范》相關(guān)要求。上述樣品可在4 ℃下最長保存2 d；如需長時間保存，應(yīng)置于-20 ℃以下。

4 樣品處理

4.1 組織樣品 取0.1～0.2 g樣品，加入1～2 mL預(yù)冷的PBS（pH 7.4），用組織勻漿機高速勻漿，制成10%組織勻漿液，以5 000 r/min 離心10 min，取200 μL上清液進行核酸提取。

4.2 液體樣品 抗凝全血、血清等液體樣品不需進行特殊處理，直接取200 μL進行核酸提取。

5 病毒核酸的提取和純化

取已進行前處理的樣品200 μL，可按傳統(tǒng)方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取試劑盒、自動化核酸提取儀提取病毒核酸。提取后的病毒核酸應(yīng)立即使用或置于-20 ℃以下冷凍保存。每次抽提核酸，應(yīng)包括一個陽性對照樣品和一個陰性對照樣品。

6 熒光PCR檢測

6.1 熒光PCR反應(yīng)液制備 在滅菌的離心管中制備符合檢測樣品數(shù)量（包括陽性、陰性對照）要求的熒光PCR反應(yīng)混合液，至少額外制備兩個樣品的量。每個樣品配制20 μL PCR 反應(yīng)混合液，組成如下：7.5 μL P72、CD2v、MGF360-505R 基因引物、探針預(yù)混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探針分別用FAM、VIC 和Cy5 進行標(biāo)記），12.5 μL 2×探針法熒光PCR預(yù)混液。

分別取20 μL PCR 反應(yīng)混合液加至每個PCR 擴增管中；再分別取5 μL DNA 模板加入到PCR 擴增管中。每次進行熒光PCR 擴增時均應(yīng)設(shè)立陽性、陰性對照。陽性對照應(yīng)用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應(yīng)用陰性對照樣品所提取核酸作為模板。加入模板后，密封PCR擴增管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在熒光PCR儀中。按下述條件運行擴增程序。

6.2 熒光PCR 擴增條件 50 ℃孵育2 min；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，45 個循環(huán)，在每一循環(huán)的60 ℃時收集FAM、VIC和Cy5通道中的熒光信號。

6.3 結(jié)果分析 Ct 值由熒光PCR 儀的軟件自動確定。

6.3.1 試驗成立條件 陽性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因無Ct 值或陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且無特異性擴增曲線，判為試驗有效。試驗無效時應(yīng)重新進行試驗。

6.3.2 P72、CD2v、MGF 360-505R 基因檢測結(jié)果判定

6.3.2.1 P72基因檢測結(jié)果判定（FAM通道）被檢樣品Ct 值≤38 且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV P72基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV P72 基因檢測陰性；38＜Ct 值＜40 且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1 次復(fù)檢，做3 個重復(fù)。至少2 個重復(fù)的Ct 值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV P72基因檢測陽性，否則判為ASFV P72基因檢測陰性。

6.3.2.2 CD2v基因檢測結(jié)果判定（VIC通道）被檢樣品Ct 值≤38 且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV CD2v 基因檢測陽性；無Ct 值或Ct 值≥40，判為ASFV CD2v 基因檢測陰性；38＜Ct 值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1 次復(fù)檢，做3 個重復(fù)。至少2 個重復(fù)的Ct 值＜40 且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV CD2v 基因檢測陽性，否則判為ASFV CD2v基因檢測陰性。

6.3.2.3 MGF 360-505R 基因檢測結(jié)果判定（Cy5通道）被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性；無Ct 值或Ct 值≥40，判為ASFV MGF 360-505R 基因檢測陰性；當(dāng)38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1 次復(fù)檢，做3個重復(fù)。至少2個重復(fù)的Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性，否則判為ASFV MGF 360-505R 基因檢測陰性。

6.3.3 綜合判定 結(jié)合P72、CD2v、MGF 360-505R等3個基因的檢測結(jié)果進行綜合判定。具體判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 綜合判定標(biāo)準(zhǔn)