錢珊珊,馮 雪,于 彤,官夢姝,李 佳,劉 月,徐 聰,侯俊財,*

(1.東北農業(yè)大學國資處,黑龍江哈爾濱 150030; 2.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

大豆蛋白活性肽是大豆蛋白經過酶解后分離得到的低聚肽混合物[1],主要由蛋白質和少量游離氨基酸等成分組成[2]。大豆活性肽是平均肽鏈長度為2～10的短肽,分子量在1000～20000 Da,其本身在原大豆蛋白序列中無活性,通過食品加工及人體內酶的作用將這些活性肽釋放出來[3]。與傳統(tǒng)大豆蛋白相比,大豆活性肽更易消化吸收,能夠迅速給機體提供能量,無豆腥味,易溶于水,酸性條件下不產生沉淀,受熱不凝固,溶液粘度低[4],大豆活性肽已被證實具有多種生物功能,主要包括免疫調節(jié)[5-7],抗氧化[8]以及降膽固醇[9-11]等功效。

隨著社會的進步,人們對健康和高質量的生活提出了更高的要求,因而尋找新的、安全有效的減肥降脂藥品或保健品已成為重要研究課題之一[12]。大豆很早就被用于治療和預防肥胖癥,大豆中的大豆蛋白通過降低饑餓感,增加脂肪代謝及促進體重降低來減少肥胖癥的發(fā)生,同時大豆還能降低肝臟中甘油三酯的累積[13]。研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白能減少肥胖小鼠和大鼠血液中甘油三酯,增加脂聯(lián)素含量,促進脂肪代謝[14]。Zhong等[15]對大豆蛋白進行堿性蛋白酶水解,然后使用凝膠過濾和反相高效液相色譜分離得到的大豆肽,其最高TC抑制率達94. 3%,通過氨基酸序列和質譜分析鑒定短肽序列顯示為WGAPSL。Takenaka等[16]采用基因定點誘變和酶解技術,從大豆蛋白中水解分離了多種具有降低膽固醇的肽段,如LPYPR、LPLPR等。包樂媛等[17]以小鼠建立實驗模型,發(fā)現(xiàn)大豆活性肽可有效降低血脂,但對高脂蛋白的調節(jié)作用不明顯。陳棟梁[18]等用含12%大豆肽和88%紫蘇油制備的降脂合劑灌胃高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠40 d,實驗組TC及TG濃度明顯低于高血脂模型組,相反,HDL濃度則明顯升高。停止灌胃1周后,血清TC仍維持在較低水平。

大豆活性肽作為一種新型大豆深加工產品,亦可作為食品、醫(yī)藥、飼料等領域的優(yōu)質原料進一步開發(fā)利用,具有較高的經濟價值和良好的市場前景[19]。本文通過建立高脂誘導小鼠肥胖模型,進行體內試驗,分析了大豆活性肽對高脂誘導引起的小鼠肥胖和血脂代謝異常的影響,為大豆肽的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 鼠齡5周左右,體重18～20 g,購于哈爾濱獸醫(yī)研究所,合格證號:SCXK(黑)2011-007;普通飼料和高脂飼料 均購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司;總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;大豆分離蛋白 谷神生物科技集團有限公司。

LGJ 21型真空冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠;DM I8倒置熒光顯微鏡 德國徠卡公司;Pellicon型小型切向流超濾系統(tǒng) 美國Millipore儀器公司;無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆活性肽的制備與分離 參考李峰等[20]的方法,并加以改進,選用風味蛋白酶作為水解酶,工藝條件為:pH7.7,底物濃度8%,酶/底物比為90 mg/g,溫度60 ℃,時間2 h。酶解后沸水浴10 min滅酶,冷卻至室溫,3000 r/min,離心20 min,取上清液即酶解液。

超濾器進樣壓力設定在0.18～0.2 MPa,用恒流泵將制備的大豆多肽液在室溫下(25 ℃)下依次通過分子截留量為 10和5 kDa的超濾膜,最后收集超濾液并進行冷凍干燥。

1.2.2 肥胖小鼠模型的建立 肥胖小鼠模型的建立參考盧申姣等人的方法[21],60只ICR小鼠,飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,晝夜明暗交替日光燈照明,自由飲水,普通飼料適應喂養(yǎng)1周后,按照體重隨機選取10只設為普通飼料組,喂養(yǎng)普通飼料,其余50只設為高脂飼料組,用高脂飼料飼養(yǎng),期間每3 d測定一次空腹體重,連續(xù)喂養(yǎng)6周后平均體質量超過對照組平均體質量1.2倍判定肥胖模型造模成功(一般認為體質量超過標準體質量的20%者為肥胖)。隨機選取建模成功的肥胖小鼠32只和普通飼料組小鼠8只用于大豆活性肽減肥試驗。

1.2.3 試驗小鼠分組及給藥 8只普通飼料組小鼠作為正常對照組,32只建模成功的ICR肥胖小鼠,隨機分為4組,高脂對照組、大豆活性肽低劑量組(200 mg/kg BW)、中劑量組(400 mg/kg BW)和高劑量組(800 mg/kg BW),連續(xù)喂養(yǎng)4周。實驗期間,小鼠均喂養(yǎng)正常飼料,各組動物單籠飼養(yǎng),環(huán)境溫度控制在(23±2) ℃,濕度控制在50%±10%,12 h光照、12 h黑暗自動控制,自由攝食飲水。

1.2.4 體重、Lee’s指數(shù)、攝食量的測定 每3 d測量小鼠體重1次,記錄飼料消耗量。在實驗的最后3 d,收集糞便,凍干并于-70 ℃保存。用鹽酸塞拉嗪注射液1 mg/kg肌肉注射進行麻醉后,測小鼠體長(從鼻尖到肛門的長度),計算Lee’s指數(shù)和體重增加量。計算公式(1)如下:

式(1)

1.2.5 肝臟分離及脂肪系數(shù)的測定 小鼠取血后,頸椎脫臼處死小鼠,立即分離肝臟,腸系膜周圍脂肪組織、左右雙側腎周脂肪組織及左右雙側附睪周圍脂肪組織,用濾紙吸干組織液后分別稱重,計算脂肪系數(shù)。計算公式(2)如下:

脂肪系數(shù)(%)=(腸系膜+雙側附睪+雙側腎周圍脂肪墊)/小鼠體重×100

式(2)

1.2.6 血清制備及其血脂指標的測定 實驗結束時,小鼠禁食12 h,不禁水,稱體重,摘眼球取血,收集血液,然后頸椎脫臼處死,將血液4000 r/min 4 ℃離心15 min得到血清,立即保存于-70 ℃。

血清TG的測定參照甘油三酯(TG)測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法),37 ℃孵育10 min,510 nm處測定吸光度。

血清TC的測定參照總膽固醇(TC)測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法),37 ℃孵育10 min,510 nm處測定吸光度。

血清HDL-C的測定參照高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(雙試劑直接法),37 ℃孵育5 min,546 nm處測定吸光度。

血清LDL-C的測定參照低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(雙試劑直接法),37 ℃孵育5 min,546 nm處測定吸光度。

1.2.7 肝臟TC的測定 采用Folch法[22]用酶法測定肝臟中TC含量。稱取0.5 g肝臟在10 mL氯仿甲醇(2∶1,v/v)中勻漿,過濾,向濾液中加入2 mL冰冷的蒸餾水,充分混勻,3000 r/min離心10 min,收集有機相用氮氣吹干后加入含10% TritonX-100的異丙醇1 mL溶解脂質,得到的樣品用試劑盒測定。

1.2.8 糞便TC的測定 在小鼠處死前3 d,收集糞便,凍干后檢測糞便中膽固醇含量,方法同1.2.7。

1.2.9 肝組織切片制備與HE染色 處死小鼠后,取肝臟組織,立即浸泡在新鮮配制的4%中性甲醛固定液中固定,將固定好的組織進行流水沖洗,制備石蠟切片,并進行HE染色,用顯微鏡在40、100倍下觀察,拍照[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 建模過程中小鼠體重變化

實驗持續(xù)6周,每3 d測1次體重,高脂模型組和普通對照組小鼠體重變化趨勢見圖1。研究開始時,普通對照組與高脂模型組小鼠體重均為18～22 g左右,高脂模型組再繼續(xù)飼喂高脂飼料后,體重增長較快,建模結束時,高脂模型組體重達到了35 g左右,而普通對照組為28 g左右,高脂模型組小鼠體重顯著高于普通對照組(P<0.05),高脂飼料組比普通飼料組小鼠體重超出20%即評定為肥胖模型建造成功[20],經造模從50只高脂飼料組中選出建模成功的肥胖小鼠32只作為高脂模型組,從普通飼料組織選出8只作為普通對照組,進行后面的大豆活性肽降脂實驗。

圖1 試驗期間小鼠體重變化Fig.1 Weight changes of mice during the experiment

2.2 大豆活性肽對小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量的影響

由表1和圖2可知,模型組與劑量組的初始體重無顯著性差異(P>0.05),模型組建模成功后改喂普通飼料不能使小鼠體重下降,而通過灌胃大豆活性肽使肥胖小鼠的體重顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,大豆活性肽處理組小鼠的體重、Lee’s指數(shù)和食物攝入量隨著大豆活性肽劑量的增加而降低。這可能是因為給小白鼠飼喂大豆活性肽能刺激產生熱能的褐色脂肪組織(BAT)的活性,提高甲狀腺素在血液中的濃度,促進體內多余脂肪的消耗[15]。另一方面,攝食量也是導致小鼠體重變化的重要原因,大豆活性肽高劑量組和中劑量組的攝食量顯著低于模型組(P<0.05),其中高劑量組與正常對照組相比無顯著性差異(P<0.05)。這說明高劑量灌胃肥胖小鼠后,小鼠的攝食量趨于正常。

表1 大豆活性肽對小鼠體重、飼料攝入量、Lee’s指數(shù)的影響Table 1 Effect of soybean peptides on body weight,food intake and Lee’s index of mice

圖2 口服不同濃度的大豆活性肽對肥胖小鼠體重的影響Fig.2 Effect of soybean peptides on the weight of obese mice

2.3 大豆活性肽對小鼠肝臟及脂肪組織重量的影響

體內脂肪重量和脂肪系數(shù)是反映小鼠肥胖程度的一個重要指標。從表2可知,各劑量組小鼠的肝臟和附睪周圍脂肪墊的相對重量降低于模型組,小鼠腸系膜和腎周圍脂肪墊的相對重量也具有同樣的趨勢但差異性并不顯著(P>0.05),可能是由于肝臟中的脂肪比起脂肪組織更早的被機體利用,所以導致肝臟的重量和腸系膜及腎周圍脂肪墊重量不同。Aoyam[24]也得到了相似的結果。而從總體來看,同模型組相比,低劑量組的脂肪系數(shù)無顯著性差異(P>0.05),中劑量和高劑量組均顯著降低小鼠的脂肪系數(shù)(P<0.05),且與正常組相比差異不顯著(P>0.05)。

表2 大豆活性肽對小鼠肝臟、脂肪組織重量(g)及脂肪系數(shù)的影響Table 2 Effect of soybean peptides on the weight of liver,lipid composition in serum and fat coefficient

2.4 大豆活性肽對小鼠血脂的影響

從表3的結果可以看出,與正常對照組相比,模型組血清TC、TG和LDL-C顯著升高(P<0.05),而HCL-C則顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,與模型組相比,高劑量組TC、TG、LDL-C指標顯著降低(P<0.05),HDL-C指標顯著提高(P<0.05);而高劑量組與正常對照組相比,TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量差異均不顯著(P>0.05),這與褚斌杰[25]等的研究結果相一致,說明大豆活性肽可以通過降低TC、TG、LDL-C含量,提高HDL-C的含量來改善小鼠體內與肥胖癥相關的指標,從而達到減肥的效果。

表3 大豆活性肽對小鼠血脂的影響Table 3 Effects of soybean peptides on serum lipid levels of mice

2.5 大豆活性肽對小鼠肝臟TC的影響

從圖3可以看出,與模型組相比,隨著大豆活性肽含量不斷增加,小鼠肝臟TC水平存在不同程度的降低,而低劑量組TC含量與模型組無顯著性差異(P>0.05),中劑量組和高劑量組TC含量顯著低于模型組(P<0.05),說明大豆活性肽可以降低脂類的合成并加速脂類的代謝,降低肥胖小鼠肝臟的膽固醇含量。這一實驗結果與劉恩岐[26]的研究結果一致,這種大豆活性肽輔助降血脂的作用具有一定的量效關系。

圖3 大豆活性肽對小鼠肝臟TC的影響Fig.3 Effect of soybean peptides on the content of total cholesterol in the lives of mice

2.6 大豆活性肽對小鼠糞便TC的影響

由圖4可知,正常對照組與高脂模型組的小鼠糞便TC含量無顯著性差異(P>0.05),說明糞便中的TC含量于攝食量無關,而大豆活性肽低、高劑量組糞便中TC含量均顯著高于正常對照組和高脂模型組(P<0.05),且低、中、高三個劑量組之間無顯著性差異(P>0.05),這是由于大豆活性肽能刺激甲狀腺激素分泌,促使膽固醇代謝生產膽汁酸。膽汁酸又被食物纖維所吸附排出體外,從而加速膽固醇的代謝,促進體內多余脂肪的消耗,可以起到降低膽固醇作用[27]。

圖4 大豆活性肽對小鼠糞便TC的影響Fig.4 Effect of soybean peptides on the content of total cholesterol in faeces of mice

2.7 大豆活性肽對小鼠肝臟切片的影響

對肝臟組織進行病理學觀察,結果如圖5所示,光鏡下HE染色顯示:正常對照組肝臟組織結構清晰完整,無脂肪變性,細胞界限清楚,細胞中央有大而圓的核,細胞質均勻,胞核大小形態(tài)正常;而高脂模型組肝細胞細胞排列松散,肝細胞腫脹,胞核變大,可見大小不一的脂滴形成,細胞變性嚴重,以中央靜脈周圍較明顯;大豆肽高、中、低劑量組均有輕到中等程度的小泡性細胞變性,但可以看出經過大豆活性肽灌胃后,肝細胞脂肪變性程度較高脂模型組明顯減輕,且高劑量組的改善效果最明顯,肝細胞空泡更小更少,形態(tài)與正常對照組相似。此實驗結果與黃謹[28]的研究結果相類似。

圖5 各組小鼠肝臟組織形態(tài)(100×)Fig.5 Observation of liver tissue morphology of mice in each group under microscope(100×)

3 結論

肥胖小鼠在灌胃大豆活性肽后,小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、肝臟及脂肪組織重量均有所降低;小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇含量顯著下降(P<0.05),而高密度脂蛋白膽固醇顯著性升高(P<0.05);肝臟組織切片結果表明,大豆活性肽能減輕肝臟的脂肪變性程度,且高劑量組的改善效果最明顯。因此,大豆活性肽對高脂誘導引起的小鼠肥胖和血脂代謝異常有良好的改善作用,且活性肽的劑量與這種改善作用具有一定的量效關系,但其作用機理目前仍不夠明確,還需進一步研究。本研究為大豆肽在食品、醫(yī)藥、飼料等領域的研究與開發(fā)提供理論依據(jù),具有重要的理論意義和社會經濟價值。