高兆建,張艷秋,宋玉林,趙宜峰

(1.徐州工程學院食品與生物工程學院,江蘇徐州 221018; 2.長江桂柳食品睢寧有限公司,江蘇徐州 221000)

細菌素是革蘭氏陽性菌產生、由核糖體合成的小分子抗菌肽[1],具有抑制某些微生物生長的作用,細菌素產生菌株通過抑制其它微生物生長而使其自身競爭中處于有利地位。產生細菌素菌株主要來源于乳酸菌并主要分布于乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)[2]。乳酸菌在發(fā)酵中利用原料中的糖發(fā)酵生成乳酸、過氧化氫、雙乙酰、細菌素和其他有機酸等產物,這些物質特別是細菌素可有效防止腐敗細菌的生長、延長食品的貨架期、增加食品的風味[3]。從安全性考慮,乳球菌屬和乳桿菌屬的乳酸菌被認為是安全性菌株(GRAS)[4],來源于以上種屬的乳酸菌細菌素比來源于其他微生物的受到更多關注[5]。

目前已經從中國傳統發(fā)酵食品中分離到大量產細菌素乳酸菌株,其中深受廣大消費者喜歡的傳統發(fā)酵食品泡菜是產細菌素乳酸菌的重要來源,如Gao等[6]從發(fā)酵卷心菜中分離到的清酒乳桿菌所產細菌素有廣譜抑菌活性,Lv等[7]從中國西北地區(qū)傳統漿水菜中分離到的棒狀乳桿菌產細菌素有良好的pH穩(wěn)定性,另外還有從發(fā)酵蘿卜[8]、發(fā)酵黃瓜等泡菜中分離產細菌素菌株的報道。并且所報道細菌素在某些方面表現出較好的應用特性,如耐酸細菌素[9]、耐高溫細菌素[5]、廣譜抗性細菌素[10]、抗真菌細菌素等。但細菌素作為一種有潛力的生物防腐劑,若在食品中廣泛使用，必須經受住食品加工過程或者食品貯藏過程的環(huán)境因素的考驗,如高溫、氧化、高鹽、蛋白酶解、疏水、高酸高堿等極端環(huán)境。但目前報道的細菌素單獨應用時其在抗菌譜、抗菌效價、穩(wěn)定性等方面仍然存在缺陷,因此進一步深入開發(fā)新型細菌素對食品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究從徐州多處采集的泡菜樣品中分離到一株產細菌素菌株發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum),盡管前期已經有多篇文獻報道了從發(fā)酵乳桿菌分離的細菌素[11-14],但其菌株篩選來源與本研究不同,并且與本研究的發(fā)酵乳桿菌所產細菌素在抑菌特性方面有差異性。本研究旨在從多樣品中分離具有潛在應用價值的產細菌素的乳酸菌菌株,通過乳酸菌發(fā)酵,在分離純化得到單一組分細菌素基礎上,進一步研究細菌素分子特性及抑菌相關性能,為細菌素在食品中開發(fā)應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 從徐州當地多處農貿市場購買泡菜用于分離產生細菌素的乳酸菌株;指示菌株 部分購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,部分由徐州工程學院江蘇省重點建設實驗室保存,具體見表2;乳酸菌篩選培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基基礎上添加0.5%(w/v)的碳酸鈣;細菌素發(fā)酵 使用MRS培養(yǎng)基;培養(yǎng)各細菌指示菌 使用LB培養(yǎng)基;柱層析填充材料Sephadex G-15 美國Pharmacia公司;超小分子量標準蛋白 TaKaRa公司;胰化蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K(30 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、木瓜蛋白酶(30 U/mg)、α-淀粉酶(30 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸、乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;其他試劑 均為國產分析純。

GeneAmp 9700 PCR儀 美國應用生物系統公司;JS-680D凝膠成像系統 上海培清科技有限公司;Sigma3k15冷凍離心機 德國SIGMA公司;UV-2450紫外可見光分光光度計 日本島津公司;DYY-6B凝膠水平電泳儀 北京市六一儀器廠;AKTA蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司;高效液相色譜半制備柱:Zorbax SB-C18(9.4 mm×250 mm,5 μm) 美國安捷倫公司產品;CascadaTM AN超純水系統 美國PALL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產細菌素乳酸菌菌株篩選

1.2.1.1 乳酸菌篩選 參照Martinez等[15]的方法并稍微修改。泡菜水按照10-1濃度依次進行梯度稀釋,選取10-1、10-2、10-3三個稀釋度涂布到MRS固體培養(yǎng)基上,34 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑取具有溶鈣圈的單個菌落革蘭氏染色,并對菌落滴加3%雙氧水后檢測是否有氣泡形成,有氣泡形成表明細胞中存在過氧化氫酶。過氧化氫酶陰性且革蘭氏陽性的菌株初始判斷為乳酸菌。將初篩的菌株MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化,挑取單菌落進行液體培養(yǎng),在-20 ℃下30%甘油保存待用。

1.2.1.2 乳酸菌的抑菌活性測定 將分離純化的乳酸菌株接種于裝有5 mL MRS液體培養(yǎng)基離心管中并在34 ℃條件下發(fā)酵48 h,10000 r/min,4 ℃離心10 min,上清液pH調至7.0并100 ℃加熱5 min,使內源性蛋白酶失活。用0.22 μm孔徑的醋酸纖維素過濾器過濾,濾液(命名為CFS)-20 ℃保存直到使用。

采用瓊脂孔擴散法[1]測定CFS的抑菌活力。于LB培養(yǎng)基平板上涂布指示菌S.aureus菌液,晾干后用打孔器打孔,將150 μL CFS注入于培養(yǎng)基孔中,37 ℃下培養(yǎng)過夜,檢測是否有抑菌圈并測量抑制圈直徑。產生抑菌圈的對應CFS中分別加入蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶,酶的終濃度2 mg/mL,在各酶最適pH下,37 ℃保溫2 h,再將pH調回至7.0,測定蛋白酶和非蛋白酶處理后對S.aureus的抑菌直徑。

抑菌活力單位的定義為:以S.aureus為指示菌,樣品經最大稀釋后,打孔檢測仍產生清晰抑菌圈的最大稀釋倍數的倒數作為一個抑菌活力單位。

1.2.2 產細菌素菌株鑒定 篩選到的菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上,34 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,對菌落形態(tài)及菌體形態(tài)鏡檢觀察。進一步通過一系列生理生化試驗進行分析。各生理生化指標測定參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行。

通過16S rDNA分析進一步鑒定菌株。以目標菌株的基因組DNA為模板,選取通用引物(16S-F:5′-AGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′;16S-R:5′-CTTGTTACGACTT-CACCC-3′)進行16S rDNA的PCR擴增。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。擴增產物連接克隆載體后測序。所得序列BLAST比對,用ClustalX 1.83與MEGA 5.1軟件,采用NJ法(Neighbor-Joining method)構建系統發(fā)育樹。

1.2.3 乳酸菌細菌素發(fā)酵 菌株劃線活化兩次后,接種于20 mL MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12～16 h按照1%(v/v)接種量接種于250 mL三角瓶裝有80 mL MRS的培養(yǎng)基中,34 ℃發(fā)酵36 h,間隔一定時間取樣,測定其吸光度(600 nm),并以S.aureus為指示菌株,瓊脂孔擴散法測定細菌素的抑菌活力。

1.2.4 細菌素的純化

1.2.4.1 硫酸銨鹽析 將硫酸銨粉末以85%的飽和度加入CFS中,4 ℃靜置過夜,再以10000 r/min、4 ℃下離心15 min。棄上清,沉淀回收,少量去離子水溶解,轉入透析袋內4 ℃去離子水透析脫鹽,并超濾濃縮后進一步層析純化。

1.2.4.2 分子篩凝膠過濾層析 采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱(1.5 cm×80 cm)層析,用20 mmol/L、pH6.5的磷酸緩沖液充分平衡后,將超濾濃縮后的樣品(1.5 mL)上樣層析柱,相同緩沖液洗脫,流速1 mL/min。檢測每管收集液抑菌活性,合并有活性的收集管超濾濃縮后進一步純化。

1.2.4.3 高效液相色譜制備 采用半制備高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫分離細菌素。洗脫體系流動相A為含0.1%三氟乙酸和5%乙腈的水溶液,流動相B為含0.1%三氟乙酸的90%乙腈溶液。檢測波長為215 nm,流速為1 mL/min。線性梯度洗脫過程為80 min內流動相A由80%到20%,柱溫25 ℃維持在一個恒定水平。

1.2.4.4 細菌素的Tricine-SDS-PAGE分子量測定與凝膠原位檢測 經系列純化后的活性組分通過Tricine-SDS-PAGE電泳測定細菌素分子量。電泳完成后將凝膠切成2份,1份用于考馬斯亮藍染色,另外1份先浸泡于含有25%異丙醇和10%乙酸的溶液中,洗滌6～8 h以洗去凝膠中的SDS,再浸泡于1% Triton X100溶液中30 min,再無菌水洗6 h,最后轉移至無菌培養(yǎng)皿中,覆蓋上一層20 mL的LB固體培養(yǎng)基,涂布S.aureus37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察抑菌條帶位置,分析細菌素分子量大小。

1.2.5 細菌素穩(wěn)定性的測定 酶對細菌素的影響:部分純化的細菌素中分別加入終濃度為2 mg/mL的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和α-淀粉酶,調節(jié)體系pH至各酶最適作用pH,37 ℃孵育2 h,再80 ℃加熱15 min以酶活酶。測定細菌素對S.aureus的抑菌活性。

溫度對細菌素的影響:部分純化的細菌素分別于40、60、80、100 ℃水浴中處理30 min,121 ℃高壓滅菌鍋15 min,冷卻后,以S.aureus為指示菌檢測抑菌活性。

pH對細菌素的影響:部分純化的細菌素用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節(jié)其pH分別至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,20 ℃保持2 h后,再將不同樣品的pH調回至7.0,以S.aureus為指示菌檢測抑菌活性。

以上實驗均以不經酶處理、pH6.0、20 ℃保存的細菌素抑菌活性為空白對照。以最高細菌素活性為100%,相對活性(%)=(各條件下測得的活性/最高活性)×100。

1.2.6 細菌素抗菌譜 指示菌株充分活化后液體培養(yǎng)至對數期,菌液稀釋至1.0×106CFU/mL,吸取150 μL涂布于各指示菌對應的固體培養(yǎng)基,再按照1.2.1.2的瓊脂孔擴散法測定抑菌活性,所用指示菌見表2。

表2 細菌素BLF52抑菌譜Table 2 Antibacterial spectrum of bacteriocin BLF52 against bacterial strains

1.2.7 細菌素對S.aureus的抑菌情況 參考文獻[16]報道的方法并稍作修改,S.aureusLB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 h分別按照10%和20%(v/v)的量分別添加發(fā)酵培養(yǎng)30 h的CFS,然后繼續(xù)培養(yǎng)至26 h。培養(yǎng)過程每2 h取樣測定OD600吸光值,分別繪制生長曲線,以不添加CFS 的S.aureus培養(yǎng)液為空白對照。

1.3 數據處理

所有檢測實驗均設置3個平行實驗,實驗數據表示為平均值±標準差。實驗數據用Excel 2010整理,SPSS 20.0統計學軟件對試驗結果差異顯著性分析,比較試驗中不同處理間差異。P<0.05認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 產細菌素菌株篩選鑒定

總共從不同泡菜水中分離得到180株乳酸菌,其中進一步篩選獲得16株菌有抑菌圈,排除乳酸及過氧化氫作用得到11株菌,進一步蛋白酶敏感性檢測,8株菌所產抑菌物質對蛋白酶敏感,再次檢測以上菌株對常見食源性致病菌的抑菌性能,篩選得到一株抑菌性能較好的菌株深入研究,該菌株命名為CH-16。菌株菌落形態(tài)(圖1)及生理生化試驗(表1)顯示:菌落較小、表面濕潤、乳白色、表面光滑、邊緣整齊;接觸酶陰性、硝酸鹽還原陰性、明膠液化陰性、吲哚試驗陰性、V-P試驗陰性、淀粉水解陰性、運動性試驗陰性;可利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖,不能利用阿拉伯糖、木糖、棉子糖,參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》初步判斷菌株CH-16為發(fā)酵乳桿菌。

圖1 發(fā)酵乳桿菌菌體形態(tài)(1000×)Fig.1 Thallus appearance of strain CH-16(1000×)

表1 菌株CH-16的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characters of strain CH-16

注意:“+”表示呈現陽性,“-”表示呈陰性。

菌株CH-16克隆獲得的16S rDNA序列在NCBI中用BLAST搜索比對,得到與其同源的基因序列,并用MEGA軟件對這些序列進行分析,構建系統進化樹。由圖2可知,該菌株與發(fā)酵乳桿菌處于同一進化分支,菌株CH-16 16S rDNA序列同L.fermentum有99%的同源性。綜合生理生化鑒定與菌體形態(tài)進一步確定菌株為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。目前,國內外已報道了從泡菜、發(fā)酵肉、發(fā)酵魚、奶酪、動物腸道等材料中分離到產細菌素乳酸菌,如Gao等[6]從發(fā)酵黃瓜中分離出一種產細菌素LactococcusgarvieaeLG34菌株;Hu等從發(fā)酵肉[1]類中分離產細菌素LactobacillusalimentariusFM-MM4;Pei等[17]從康普茶中分離出細菌素產生菌株Lactobacillusplantarum。乳酸菌屬早已被證實是安全無毒的菌種,發(fā)酵乳桿菌也已經被確認為GRAS(Generally Recognized as Safe)物質[11]。目前雖然從泡菜中分離出多種產細菌素的乳酸菌菌株,但發(fā)酵乳桿菌鮮有報道。

圖2 基于發(fā)酵乳桿菌CH-16 16S rDNA序列系統發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree drived from the 16S rDNA sequence of L. fermentum CH-16 strain

2.2 乳酸菌生長動力學及細菌素合成

結果如圖3所示。菌株接種后3 h進入指數生長期,快速生長至12 h后菌株生長減緩,從24 h左右進入穩(wěn)定期,OD600在2.2左右維持穩(wěn)定?？咕镔|BLF52在發(fā)酵9 h即指數中后期開始合成,從抑菌活力曲線來看隨著菌體量增長,BLF52的產量也在不斷增加,BLF52活力和菌體密度呈現密切正相關。當發(fā)酵時間達到21～30 h時,即菌株對數期的后期、穩(wěn)定期的前期,發(fā)酵液中BLF52活力達到最大875 AU/mL。在30～36 h這段時間里BLF52抑菌活性有所下降,推測菌體釋放的蛋白酶降解了部分細菌素。從菌體生長曲線和細菌素合成量判斷,BLF52為初級代謝產物。細菌素產量高低是評價其是否具有開發(fā)應用價值的重要指標。以S.aureus為指示菌株BLF52最大活力為875 AU/mL,相比來源于LeuconostocmesenteroidesE131[18](1280 AU/mL)、Lactobacillusparacasei[19](1800 AU/mL)、StaphylococcushaemolyticusMSM[20](2500 AU/mL)等微生物的細菌素產量略低,但考慮到本研究的菌株為初步篩選獲得的野生菌株,還未經過誘變篩選,也未經發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化,故抗菌物質BLF52發(fā)酵活力還有較高的提升空間。

圖3 發(fā)酵乳桿菌CH-16生長動力學及細菌素BLF52合成Fig.3 Growth kinetics of L. fermentum CH-16 and bacteriocin BLF52 production

2.3 細菌素分離純化

發(fā)酵上清液CFS經硫酸銨鹽析、透析和超濾后上樣Sephadex G-15層析柱進一步純化,經洗脫得到68管收集洗脫液,每管收集4 mL,所有洗脫管分為7組樣品分別以S.aureus檢測抑菌活性,結果顯示第5組樣品含有抑菌活性,其它無活性顯示。硫酸銨鹽析、透析及超濾去除了部分色素及雜蛋白,并有效濃縮樣品為后續(xù)高效柱層析提供基礎。凝膠過濾層析去除了大量殘余色素,并將細菌素同大分子蛋白高效分離。經過前期純化后的細菌素樣品合并濃縮后進一步通過半制備液相色譜純化,液相色譜圖如圖4所示,在80 min的洗脫時間中共洗脫出9個峰,且第9峰以后無洗脫峰出現,表明洗脫完全,分別對這九個峰值洗脫液通過濾紙片法檢測抑菌活性,如圖4中所示,第6峰可以觀察到明顯的抑菌圈,其他八個峰沒有抑菌圈出現。由此表明,前期的分離純化雖然去除了大量蛋白、多糖及色素等雜質,但不能得到單一組分,半制備液相分離出很多雜質峰,將細菌素和雜質實現了較好的分離。目前,國內外文獻報道了細菌素多種純化方法,如陰離子交換層析、凝膠過濾層析[21]、硫酸銨沉淀[21]、陽離子交換層析及RP-HPLC等。同文獻報道的純化方法相比,本研究純化步驟相對簡單,特別是半制備高效液相色譜法純化效率高,可以借鑒使用。

圖4 細菌素BLF52的高效液相色譜純化Fig.4 Purification of bacteriocin BLF52 by HPLC

2.4 Tricine-SDS-PAGE分子量測定

將經過85%硫酸銨飽和度沉淀、透析、超濾濃縮、Sephadex G-15凝膠分子篩層析及HPLC等各純化步驟后收集的抑菌活性組分進行Tricine-SDS-PAGE檢測,結果如圖5所示,1號泳道顯示清晰的單一蛋白條帶,基本無雜質蛋白。2號為凝膠原位抑菌實驗結果,顯示明顯的抑菌帶,其位置同1號泳道蛋白條帶位置一致,表明純化得到的條帶為細菌素樣品。根據標準分子量蛋白相對遷移率計算得到細菌素分子量5.6 kDa,處于大部分報道的細菌素分子量范圍內。不同來源的細菌素分子量往往不同,源自LactobacillusacidophilusMS1細菌素為6.5 kDa[21];PediococcusacidilacticiHW01的細菌素為6 kDa[22];Lysinibacillussp.的細菌素為51 kDa[23],均高于本研究細菌素分子量。而源自LactobacillusalimentariusFM-MM4的細菌素為1.104 kDa[1],Lactobacillusplantarum細菌素3.4 kDa[24],均小于本實驗的細菌素。而且本研究的細菌素分子量同最近報道的源于LactobacillusfermentumBZ532(1.105 kDa)細菌素分子量差異顯著,故BLF52可能是一種新型的細菌素。

圖5 純化的細菌素BLF52 Tricine-SDS-PAGE分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE of purified bacteriocin BLF52注:M:超小標準分子量蛋白Marker; 1:HPLC活性峰樣品;2:凝膠原位抑菌實驗。

2.5 細菌素BLF52穩(wěn)定性

2.5.1 細菌素的蛋白酶敏感性 熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性是細菌素能否作為食品防腐劑應用的重要指標之一。部分純化的BLF52經蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后,細菌素活性完全喪失,表明純化的抑菌物質是具有蛋白質特性結構,而α-淀粉酶處理后,抑菌活性基本無變化,由此表明抑菌物質結構中不存在與其活性重要相關的淀粉鏈。文獻報道的LactobacillusplantarumMBSa4[25]、LactobacillussakeiGM3[26]等乳酸菌細菌素在蛋白酶作用后失去全部活性,但Perumal等[27]報道的EnterococusfaecalisCV7細菌素活性幾乎不受多種蛋白酶的影響,表明不同細菌素其氨基酸組成和結構不同,則對不同蛋白酶的敏感性有差別。

2.5.2 細菌素的熱穩(wěn)定性 BLF52在溫度40～80 ℃之間穩(wěn)定性較好(圖6),相對活性均保持在90%以上,80 ℃以后抑菌活性開始出現明顯下降,但在100 ℃抑菌活性仍保持86.2%,在121 ℃處理15 min后,抑菌活性在43.5%,這與EnterococcusfaecalisKT2W2G[15]細菌素相似,其在100 ℃附近較為穩(wěn)定,在121 ℃加熱30 min后,其活性降低至50%。不同來源的細菌素的溫度穩(wěn)定性不同[5,28],說明不同微生物菌株所合成的細菌素結構不同,氨基酸的構成存在差異。

圖6 細菌素BLF52熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of bacteriocin BLF52

2.5.3 細菌素的酸堿穩(wěn)定性 細菌素BLF52在pH2.0～7.0之間,相對活性都保持在90%以上(圖7);pH8.0～10.0穩(wěn)定性逐漸降低,pH10時活性保持在43.6%。由此看出BLF52更適合弱酸性或中性環(huán)境下使用,這與其他文獻報道的細菌素穩(wěn)定性相類似但又不完全相同,Wen等[29]從LactobacillusplantarumK25中分離的細菌素pH穩(wěn)定性在2.0～8.0之間;Lv等[5]研究的細菌素pH穩(wěn)定性在2.5～5.5之間。細菌素BLF52在使用環(huán)境pH7.0以下的酸性范圍效果更佳。

圖7 細菌素BLF52 pH穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of bacteriocin BLF52

2.6 細菌素BLF52抑菌譜

細菌素BLF52抑菌情況如表2所示,對革蘭氏陽性菌如單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽胞桿菌有非常強的抑菌活性,對糞腸球菌稍弱,對乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌無抑菌活性;對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌有較弱的抑菌活性,對志賀氏菌無抑菌活性。整體看,指示菌對BLF52的敏感性存在差異,革蘭氏陽性菌相比革蘭氏陰性菌對BLF52更敏感,BLF52對所試的全部乳酸菌無作用,這與目前國內外所研究的乳酸菌素對乳酸菌類基本無抑制作用的特性相一致[30]。但BLF52對常見的食源性致病菌表現出廣譜抑菌特性,如對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌菌有抑菌活性,這對其在食品中作為防腐劑使用對食品安全性具有重要意義。根據以往的文獻報道,乳酸菌抑菌物質的抑菌譜較窄[31],對革蘭氏陰性菌沒有明顯的抑制作用,而且不同菌種產生的細菌素抑制譜不同[1,5],同報道的文獻相比,BLF52在抑制食源性致病菌方面更有優(yōu)勢,其有潛力開發(fā)為天然食品防腐劑。

2.7 細菌素對S. aureus的抑制作用

細菌素BLF52對S.aureus生長抑制情況如圖8所示,從不加BLF52的曲線來看,0～2 h菌體處于延遲期,生長緩慢;在2～8 h內,菌體生物量增長迅猛,曲線較陡,吸光度值從0.045升至1.797,而在8 h之后,菌體生物量增長速率逐漸緩慢。在菌體生長2 h后添加不同量的細菌素,2～4 h,菌體生長依然均呈現延遲期的特征,生長緩慢,但4 h后,兩者菌體量都開始逐漸增加,但同空白對照相比,菌體繁殖速度顯著緩慢;指示菌培養(yǎng)12 h后,添加10% CFS的指示菌培養(yǎng)液吸光值達到0.602,且12～24 h吸光值無明顯變化,24 h后開始增加;添加20% CFS的培養(yǎng)液菌體生長情況較10%的抑制作用更為強烈,14 h后菌體量逐漸減少,26 h吸光值達到最低0.125。整體表明細菌素對生長中的S.aureus有顯著的抑制作用,并通過殺菌模式達到抑菌作用。本研究細菌素對指示菌的抑制情況同文獻報道的EnterococcusfaeciumAQ71[16]細菌素相似。

圖8 發(fā)酵乳桿菌CH-16發(fā)酵液CFS 對S. aureus的抑制作用Fig.8 Effect of cell-free supernatant(CFS)of strain L. fermentum CH-16 on the growth of S. aureus

3 結論

本研究從傳統泡菜中分離到一株產細菌素菌株L.fermentumCH-16。通過分子篩凝膠層析和HPLC純化到單一組分細菌素,其分子量同已報道發(fā)酵乳桿菌細菌素有顯著區(qū)別,推測BLF52為一種新型細菌素。BLF52對G+菌及G-菌均有抑菌活性,但對G+菌抑制活性更強,對常見的食源性致病菌如單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌菌有抑菌活性,但對所試乳酸菌無抑菌活性。BLF52熱穩(wěn)定性好,100 ℃加熱30 min,活性扔接近80%;且具有良好的酸堿耐受性,pH2.0～7.0環(huán)境下2 h活性保持80%以上。細菌素BLF52有潛力在食品特別是酸性食品中作為生物防腐劑使用。