馬嘉燁，徐進(jìn)川，晏博，盧水華

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核病研究中心，上海 201508

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年的全球結(jié)核病報(bào)告，2019年在全球范圍內(nèi)約有710萬結(jié)核病新發(fā)病例，發(fā)病率為130/10萬[1]。在單一傳染病中，結(jié)核病導(dǎo)致的死亡人數(shù)最高，仍然是世界上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。我國作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，新發(fā)病例數(shù)為83.3萬，位居全球第二，發(fā)病率為58/10萬[1]。除了活動性結(jié)核病，全球還有大量的結(jié)核潛伏感染者。結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)是機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌抗原持續(xù)性免疫反應(yīng)的狀態(tài)，無活動性結(jié)核病臨床癥狀，也無結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn)[2]。2014年，全球約有17億人為LTBI，占全球人口總數(shù)的23%[3]。2015年中國第一項(xiàng)大規(guī)模多中心LTBI的前瞻性隊(duì)列研究在4個農(nóng)村研究點(diǎn)進(jìn)行，共 21 022 人，結(jié)果顯示結(jié)核潛伏感染者約占13%～20%[4-5]。結(jié)核潛伏感染者一生中進(jìn)展為活動性結(jié)核病的概率約為5%～10%[2]，是活動性結(jié)核病的重要來源。一項(xiàng)系統(tǒng)綜述顯示，約11%結(jié)核抗原免疫反應(yīng)陽性的LTBI人群在免疫抑制時可進(jìn)展為結(jié)核病，且主要集中在感染后兩年內(nèi)發(fā)病[6]。2015年美國通過國家結(jié)核病監(jiān)測和基因分型數(shù)據(jù)估算近期傳播的結(jié)核病病例比例，研究表明超過85%的結(jié)核病病例源自LTBI的再激活[7]。因此，準(zhǔn)確診斷LTBI人群，確定有效的干預(yù)方案，可以極大地降低結(jié)核發(fā)病率和治療成本，而一個簡單易行的標(biāo)準(zhǔn)化LTBI模型對于上述問題的解決將十分重要。鑒于此，本文對近年來LTBI動物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，期望對結(jié)核病防治有所裨益。

1 LTBI動物模型研究現(xiàn)狀及定義

LTBI是否進(jìn)展為活動性結(jié)核病取決于細(xì)菌和宿主免疫系統(tǒng)復(fù)雜的相互作用。在大多數(shù)情況下，宿主免疫力低下時LTBI狀態(tài)容易被激活成活動性結(jié)核病。目前，對于人感染M.tb后進(jìn)入潛伏期的機(jī)制和再激活的原因仍不清楚，主要因?yàn)橐环矫婺壳皩τ贚TBI的臨床診斷還缺乏金標(biāo)準(zhǔn)[1]，另一方面缺乏簡單易行的標(biāo)準(zhǔn)化LTBI動物模型[8-9]。已有報(bào)道的LTBI動物模型主要分為2類：一類為自然潛伏感染；另一類為干預(yù)(抗結(jié)核藥物或疫苗等)誘導(dǎo)的潛伏感染[10-13]。目前，最常用的動物感染模型為小鼠模型，而豚鼠、兔子和非人靈長類等哺乳動物以及斑馬魚等非哺乳類動物，因各自的優(yōu)勢特點(diǎn)也有頗多研究報(bào)道[14-17]。以小鼠模型為例，目前文獻(xiàn)中對LTBI動物模型普遍定義為：肺、脾中菌持續(xù)存在，但荷菌量穩(wěn)定；長期無活動性結(jié)核病的臨床癥狀(小鼠表現(xiàn)為體重減輕，活躍度降低，出現(xiàn)過度的舔舐、抓撓行為及異常的呻吟，開始出現(xiàn)駝背，呼吸淺快，眼、鼻具有分泌物等癥狀)；長時間內(nèi)無自發(fā)性復(fù)發(fā)；糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑可重新激活細(xì)菌，轉(zhuǎn)為活動性結(jié)核病[10]。

圖1 干預(yù)誘導(dǎo)LTBI動物模型框架

2 常見LTBI動物模型的建立及其應(yīng)用

2.1 小鼠LTBI模型

2.1.1 自然形成潛伏感染模型20世紀(jì)60年代，Hart和Rees等[18-20]研究抗結(jié)核藥物在不同感染狀態(tài)下(急性感染和慢性感染)的殺菌能力時，提出了小鼠結(jié)核慢性感染模型，但因接種菌量高(8×106CFU)，24%的小鼠在第5周時即死于進(jìn)行性發(fā)展的活動性結(jié)核病。20世紀(jì)末，Orme[21]、Phyu等[10]、Arriaga等[22]使用不同菌株(H37Rv或Erdman株等)，不同菌量，通過不同的感染途徑感染(C57BL/6×DBA/2)小鼠，對構(gòu)建LTBI小鼠模型的條件進(jìn)行了探索(見表1)。其中Phyu等[10]提出4×104～4×105CFU H37Rv株腹腔注射感染小鼠，感染后21～52周小鼠無活動性結(jié)核病的臨床癥狀(小鼠體重減輕、活躍度降低、呼吸淺快等癥狀)，且肺、脾中能維持穩(wěn)定的荷菌量，肺臟沒有大體形態(tài)學(xué)改變及病理學(xué)改變。53周開始，每天給予口服皮質(zhì)類固醇激素(初始劑量為最終劑量1.07 mg的25%，按初始劑量服用10周后逐漸加倍，13周達(dá)最終劑量)，小鼠出現(xiàn)結(jié)核急性感染癥狀，器官荷菌量上升，病理改變逐漸加重，肉眼可見灰色針尖樣結(jié)節(jié)，鏡下可見炎癥細(xì)胞聚集性肉芽腫結(jié)構(gòu)，組織細(xì)胞內(nèi)可見分枝桿菌抗原；而未口服皮質(zhì)類固醇激素的小鼠存活了100周以上，在107周左右開始進(jìn)展成活動性結(jié)核病[10]。此模型很好地模擬了自發(fā)形成潛伏感染的特點(diǎn)，但其潛伏期較長(可長達(dá)107 周)，對于潛伏-復(fù)發(fā)機(jī)制研究，以及利用復(fù)發(fā)情況來進(jìn)行藥物和疫苗的評價來說研究周期過長。

2.1.2 干預(yù)誘導(dǎo)潛伏感染模型為縮短建模周期，便于研究結(jié)核潛伏感染復(fù)發(fā)機(jī)制等，眾多研究者利用抗結(jié)核藥物或疫苗等對LTBI動物模型進(jìn)行了改進(jìn)。

Cornell模型是最經(jīng)典的小鼠干預(yù)誘導(dǎo)形成的LTBI模型，20世紀(jì)50年代由McCune及其同事在美國康奈爾大學(xué)提出[11, 23-25]。在Cornell模型中，M.tb感染的小鼠喂食含異煙肼(isoniazid, INH)和吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)的飼料后，組織中可呈現(xiàn)長期無菌狀態(tài)(低于檢測下限)，停用抗結(jié)核藥物一段時間后，結(jié)核桿菌可重新激活恢復(fù)培養(yǎng)陽性的狀態(tài)。在該模型中，使用1×106～3×106CFU H37Rv株靜脈注射感染雄性Swiss Webster小鼠，感染后20 min內(nèi)開始用INH(每日飼料0.0125%)和PZA(每日飼料2%)治療持續(xù)12周。治療37天后，在肺和脾中均檢測不到細(xì)菌。但停藥后90天，大約1/3受檢動物的肺和脾臟中可檢測到結(jié)核桿菌。治療完成后使用大劑量可的松會使M.tb重新激活，可的松可導(dǎo)致50%的小鼠恢復(fù)培養(yǎng)陽性狀態(tài)的時間從7個月縮短至2.5個月。

20世紀(jì)末21世紀(jì)初，Scanga等[12]和Flynn等[26]、Botha和Ryffel[27]基于Cornell模型，在感染菌量、抗結(jié)核藥物治療持續(xù)時間、藥物劑量以及藥物停止使用至免疫干預(yù)開始的時間間隔方面做了一系列改進(jìn)，提出了多種Cornell改進(jìn)模型。其中，Scanga等[12]運(yùn)用1×105CFU Erdman株靜脈感染小鼠，感染4周后用PZA(8 g/L)和INH(0.1 g/L)治療12周，治療后肺、脾勻漿培養(yǎng)呈陰性，之后126天均未觀察到LTBI的自發(fā)激活；而在完成抗生素治療11周后進(jìn)行MP6-XT22(鼠TNF-α抗體)干預(yù)組，96天后60%小鼠肺、脾勻漿培養(yǎng)呈陽性，126天全部小鼠可見LTBI重新激活。Botha和Ryffel[27]則用30 CFU H37Rv株以氣溶膠途徑感染C57BL/6小鼠，感染后2周在飲水中添加RMP(Rifampicin, 0.1 g/L)和INH(Isoniazid, 0.1 g/L)治療8周，停止治療20周后給予2.5% (wt/vol) 氨基胍(iNOS抑制劑)，干預(yù)2周即可見到LTBI重新激活，肺中荷菌量顯著上升，而未干預(yù)組55周時仍未有自發(fā)激活現(xiàn)象，肺勻漿培養(yǎng)仍為陰性。Scanga和Botha的方法均實(shí)現(xiàn)了短時間內(nèi)無自發(fā)激活現(xiàn)象但用免疫抑制劑等干預(yù)可誘發(fā)LTBI再激活的目標(biāo)，達(dá)到大量活菌存留的慢性感染狀態(tài)和細(xì)菌清除的疾病治愈狀態(tài)之間的平衡。

小鼠Cornell模型及其變體具有極低數(shù)量或無法檢測到的M.tb，并可維持此狀態(tài)數(shù)周(見表1)，其已被廣泛用于抗結(jié)核藥物治療方案的有效性評估[28-31]、疫苗評價[32]，以及LTBI的免疫學(xué)、病原學(xué)研究和潛伏感染機(jī)制及潛伏-復(fù)發(fā)機(jī)制的研究。但有研究認(rèn)為， Cornell模型的潛伏期是人為誘導(dǎo)，且在感染后20 min內(nèi)即開始抗結(jié)核治療，干擾了宿主對感染的自然免疫反應(yīng)，未關(guān)注宿主免疫在維持潛伏感染中的作用，早期免疫機(jī)制無法研究。長期抗結(jié)核藥物治療可引起M.tb表型發(fā)生改變，形態(tài)、生長和抗酸染色上具有差異，如在研究Cornell模型變體時發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥物治療后運(yùn)用免疫抑制劑重新激活的結(jié)核分枝桿菌在培養(yǎng)基上呈非典型小而光滑的菌落，抗酸染色陰性且無法在7H9中傳代培養(yǎng)，但PCR擴(kuò)增證明其為結(jié)核分枝桿菌[12]。

因此，除了運(yùn)用抗結(jié)核藥物，美國約翰霍普金斯結(jié)核研究中心Nuermberger等[13]提出，運(yùn)用BCG等疫苗提前免疫小鼠，增強(qiáng)自身免疫控制M.tb感染，使小鼠最終處于潛伏感染狀態(tài)(<104CFU/肺)。其用BCG通過氣溶膠(2.3×108CFU/mL)和靜脈途徑(5×105CFU/mL)提前免疫雌性BALB/c小鼠，免疫6周后，氣溶膠途徑感染500 CFU H37Rv株，感染后第6周，未免疫組小鼠肺中菌落計(jì)數(shù)比BCG提前免疫組(靜脈/氣溶膠途徑)小鼠高20～200倍，提前免疫組脾中未檢出菌，未免疫組脾中菌量仍高達(dá)2.75×104CFU，且未免疫組小鼠肺部病理損傷及肉芽腫改變均比提前免疫組嚴(yán)重。因此，BCG氣溶膠途徑提前免疫小鼠可使小鼠更能抵抗之后的M.tb攻擊。之后，Nuermberger等[33]運(yùn)用此模型有效評估了多種LTBI治療方案，得出3HP(利福噴汀聯(lián)合異煙肼，3個月，每周1次)與6H和9H(異煙肼，6/9個月，每日1次)療效相當(dāng)，為制定改進(jìn)LTBI治療方案提供了一定的參考。隨后， Nuermberger團(tuán)隊(duì)[34]進(jìn)一步改進(jìn)了此模型，運(yùn)用免疫原性更強(qiáng)的rBCG30和ticeBCG提前免疫小鼠，使小鼠菌量穩(wěn)定保持在104CFU以下。C3HeB/FeJ小鼠的研究，表明其能發(fā)展出干酪樣壞死和缺氧性病變[35]，又在上述模型基礎(chǔ)上將BALB/c小鼠改進(jìn)為C3HeB/FeJ小鼠，建立了可以發(fā)展成干酪樣壞死性肉芽腫的LTBI小鼠模型，并有效驗(yàn)證了多種新型抗結(jié)核藥物及聯(lián)合治療方案的有效性，且證明了C3HeB/FeJ小鼠中療效與BALB/c小鼠相當(dāng)[36]。

2.2 其他哺乳動物L(fēng)TBI模型

2.2.1 豚鼠LTBI模型常見的幾種小鼠品系在感染M.tb后肺部不能出現(xiàn)典型的肉芽腫結(jié)構(gòu)，因此曾被認(rèn)為不適合作為研究肉芽腫相關(guān)的動物模型。而豚鼠結(jié)核感染模型能夠形成與結(jié)核病人非常相似的中央干酪樣壞死性肉芽腫，因此成為研究肺結(jié)核肺部組織病理學(xué)的熱門選擇[37]，也有較多研究者利用豚鼠構(gòu)建LTBI模型。但豚鼠對M.tb的劑量高度敏感，無論是通過靜脈還是氣溶膠低劑量感染，都易進(jìn)展成活動性結(jié)核病導(dǎo)致體重減輕甚至死亡。為了解決這個問題，Kashino等[14]用鏈霉素營養(yǎng)缺陷型M.tb菌株18b構(gòu)建豚鼠潛伏感染模型，此模型豚鼠肺、脾部的菌量降至100 CFU以下，未出現(xiàn)活動性結(jié)核病的臨床癥狀，但本實(shí)驗(yàn)中未明確證明此豚鼠潛伏感染模型能否重新激活。國內(nèi)也有構(gòu)建豚鼠LTBI模型的研究，黎友倫等[38]運(yùn)用500 CFU H37Rv株通過腹股溝皮下注射感染雌性健康豚鼠，感染2周后用10 mg/kg異煙肼和40 mg/kg吡嗪酰胺灌胃，每周3次，分別治療4、8和12周停藥，停藥后繼續(xù)飼養(yǎng)。8周和12周較長時間的治療可顯著抑制M.tb在豚鼠體內(nèi)增殖，肺、脾中菌不可檢出，長時間停藥或經(jīng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，可導(dǎo)致部分豚鼠的結(jié)核病自然復(fù)發(fā)或誘導(dǎo)復(fù)發(fā)。豚鼠在疫苗質(zhì)量控制、有效性和安全性評估中也具有重要的應(yīng)用價值。盧錦標(biāo)等[39]用5×103CFUM.tb(CMCC95052)經(jīng)腹股溝皮下注射感染Hartley豚鼠構(gòu)建潛伏感染狀態(tài)，并通過此模型驗(yàn)證了AEC/BC02和AEC/BC03兩種疫苗在控制臟器菌量和減輕臟器病理改變中的作用[40]。

2.2.2 兔LTBI模型兔在結(jié)核分枝桿菌感染后也會形成與結(jié)核病人結(jié)構(gòu)相似的肉芽腫結(jié)構(gòu)。并且兔的結(jié)核感染模型能夠展現(xiàn)出人類感染結(jié)核后的多種階段，如：活動性結(jié)核病、自發(fā)形成LTBI或隨著時間推移細(xì)菌清除，疾病消退[41-42]。21世紀(jì)初，Manabe等[15]、Subbian等[42]運(yùn)用H37Rv株或臨床分離的M.tb CDC1551株等以氣溶膠途徑感染雌性新西蘭白兔構(gòu)建兔LTBI模型，兩者兔肺中均未檢測到M.tb，無自發(fā)激活現(xiàn)象，而運(yùn)用糖皮質(zhì)激素類藥物干預(yù)則能激活潛伏感染狀態(tài)。

2.2.3非人靈長類LTBI模型 非人靈長類具有與人類相似的結(jié)核肉芽腫結(jié)構(gòu)，可模擬人類結(jié)核病自然潛伏感染的過程，重現(xiàn)人類LTBI的臨床特征[43]，是人類結(jié)核病重要的研究模型。21世紀(jì)初，Capuano等[16]將約25 CFUM.tbErdman株通過支氣管鏡滴入成年食蟹猴肺中，觀察到其中50%～60%的猴子出現(xiàn)慢性活動性感染，最后進(jìn)展為晚期結(jié)核病，約40%的猴子沒有發(fā)病，呈現(xiàn)出人類LTBI的特點(diǎn)。2010年，該團(tuán)隊(duì)又在上述食蟹猴模型的基礎(chǔ)上驗(yàn)證了腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)抑制劑會影響肉芽腫結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致活動性結(jié)核病進(jìn)展，出現(xiàn)爆發(fā)性和播散性結(jié)核，也能重新激活LTBI[44]。和兔模型一樣，非人靈長類肺結(jié)核模型中不同猴子品種感染不同的M.tb菌株(Erdman株和H37Rv株)，通過不同的感染途徑，均可導(dǎo)致不同的臨床結(jié)局[45]。如上述食蟹猴低劑量感染模型表現(xiàn)出人類M.tb感染的全貌，展現(xiàn)了不同的臨床結(jié)局和組織病理變化。臨床結(jié)局包括迅速進(jìn)展的結(jié)核病、慢性活動性結(jié)核感染和LTBI，組織病理包括干酪性肉芽腫、固體細(xì)胞性肉芽腫和纖維鈣化性肉芽腫[16]。這些優(yōu)點(diǎn)結(jié)合先進(jìn)的成像技術(shù)和基因編碼技術(shù)使非人靈長類動物模型成為研究M.tb感染發(fā)病機(jī)制、宿主與結(jié)核分枝桿菌相互作用、活動性結(jié)核和LTBI的免疫學(xué)變化及肉芽腫組織病理的優(yōu)勢模型[46-47]，并在評估新型候選抗結(jié)核藥物、新型疫苗臨床前有效性及安全性，制定和改進(jìn)抗結(jié)核聯(lián)合治療方案，評估抗菌藥物在預(yù)防LTBI再激活的功效中發(fā)揮重要作用[48-49]。同時，目前有較多研究使用非人類靈長類LTBI模型研究結(jié)核分枝桿菌-人類免疫缺陷病毒(TB-HIV)共感染個體中早期免疫學(xué)指標(biāo)的變化和HIV誘導(dǎo)LTBI重新激活的機(jī)制，預(yù)測再激活風(fēng)險的生物學(xué)指標(biāo)，為TB-HIV共感染人群預(yù)測再激活風(fēng)險并及時進(jìn)行抗結(jié)核治療提供了重要的依據(jù)[50-53]。但是，非人靈長類動物M.tb感染模型飼養(yǎng)成本和感染后維護(hù)成本非常高，需要使用的大動物P3實(shí)驗(yàn)室硬件要求高，較難大規(guī)模推廣使用。

2.3 非哺乳動物L(fēng)TBI模型

2.3.1 斑馬魚LTBI模型除上述哺乳動物外，斑馬魚因其遺傳學(xué)操作便利，且無須使用高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢，開始逐步運(yùn)用到宿主與分枝桿菌相互作用的研究。斑馬魚是海分枝桿菌的天然宿主，其感染海分枝桿菌后可形成與人類相似的肉芽腫結(jié)構(gòu)并形成干酪樣壞死。斑馬魚LTBI模型的建立最早被Parikka的研究小組報(bào)道，Parikka等[17]使用約35 CFU低劑量海分枝桿菌(ATCC 927)腹腔注射感染成年野生型AB斑馬魚，感染4周后形成潛伏感染狀態(tài)，荷菌量、肉芽腫數(shù)量穩(wěn)定。感染后5個月，給予2次γ射線(25Gy)照射后，斑馬魚陸續(xù)死亡，終點(diǎn)死亡率為88%。2018年，該研究小組在上述LTBI模型的基礎(chǔ)上改用地塞米松進(jìn)行免疫抑制，地塞米松也可重新激活LTBI狀態(tài)，器官內(nèi)菌量開始增加，肉芽腫數(shù)目增多，結(jié)構(gòu)變大、變松，分枝桿菌逸散到組織中[54]。雖然斑馬魚作為LTBI模型的研究目前還比較少，且其免疫學(xué)研究相關(guān)的抗體等資源商品化產(chǎn)品還不夠完善，需要研究者自行開發(fā)定制。但斑馬魚LTBI模型的建立成本相對較低，培養(yǎng)周期快，斑馬魚的免疫系統(tǒng)和人相比高度保守，易于進(jìn)行基因操作，在胚胎及幼蟲前期保持透明，可在熒光標(biāo)記下實(shí)時觀察細(xì)菌和免疫細(xì)胞的相互作用，使得該模型在研究宿主-分枝桿菌的相互作用、分枝桿菌潛伏-復(fù)發(fā)感染的機(jī)制等方面具有一定的優(yōu)勢。

3 LTBI模型評估指標(biāo)

在小鼠LTBI模型中，大多依據(jù)器官勻漿CFU菌落計(jì)數(shù)、器官大體形態(tài)學(xué)改變、組織病理學(xué)改變(Ziehl-Neelsen抗酸染色：直接觀察組織中結(jié)核分枝桿菌載量；HE染色：觀察組織器官中肉芽腫數(shù)目及結(jié)構(gòu)變化；免疫組織化學(xué)：檢測結(jié)核分枝桿菌抗原或相關(guān)細(xì)胞因子)來判定小鼠是否處于潛伏感染狀態(tài)[10-13]，部分研究額外進(jìn)行肺組織結(jié)核分枝桿菌DNA原位PCR檢測，或檢測結(jié)核感染相關(guān)細(xì)胞因子包括IFN-γ(干擾素)、TNF-α、iNOS、IL-1(白細(xì)胞介素)等的表達(dá)情況[22]。文獻(xiàn)中小鼠LTBI狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)一般為小鼠肺、脾(和肝)中檢測不到活菌(低于檢測下限)或CFU計(jì)數(shù)保持穩(wěn)定不增長的狀態(tài)，肺、脾(和肝)中未見炎癥浸潤及肉芽腫病理改變或只見細(xì)小肉芽腫但長時間內(nèi)無數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化。但Phyu等[10]的研究表明，疾病臨床癥狀嚴(yán)重程度和器官勻漿CFU計(jì)數(shù)無規(guī)律的相關(guān)性，而和組織病理學(xué)改變的嚴(yán)重程度相關(guān)，且從器官勻漿中得到的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間較長(2個月以上)，表明其從休眠期恢復(fù)存在較長的遲滯期。因此，判斷小鼠處于LTBI狀態(tài)須合并小鼠的一般狀態(tài)(體重、毛發(fā)、呼吸等)、器官菌落計(jì)數(shù)、器官組織病理學(xué)表現(xiàn)或脾臟和肝臟重量、大小變化等因素來綜合評估。

而在非人靈長類LTBI模型中，由于其與人類在親緣關(guān)系上最為接近，可展現(xiàn)類似人感染M.tb后的多種臨床結(jié)局，如活動性結(jié)核病和LTBI等，可結(jié)合臨床指標(biāo)及多種無創(chuàng)影像學(xué)檢查來判斷非人靈長類是否處于LTBI狀態(tài)。文獻(xiàn)中多定義為感染后無活動性結(jié)核病臨床癥狀(如體重減輕、咳嗽等)，無結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn)，無病原學(xué)證據(jù)(如：支氣管肺泡灌洗液或胃抽吸物等M.tb培養(yǎng)陰性)及炎癥指標(biāo)正常(紅細(xì)胞沉降率正常)等[55]。

4 LTBI模型驗(yàn)證

在確定已建立的小鼠模型是否為LTBI狀態(tài)時，常將已建立的小鼠LTBI模型分為2組：一組運(yùn)用已被廣泛認(rèn)可與結(jié)核感染相關(guān)的免疫抑制劑(地塞米松、可的松、氨基胍(iNOS抑制劑)、TNF-α抑制劑等)；一組則不予干預(yù)。驗(yàn)證小鼠LTBI狀態(tài)在免疫抑制的情況下是否可被激活及短時間內(nèi)是否有大量的自發(fā)激活現(xiàn)象，若感染菌量過少，藥物治療時間過長等導(dǎo)致細(xì)菌已被完全清除，免疫抑制狀態(tài)下也無法誘導(dǎo)激活；或短時間內(nèi)即有較多小鼠出現(xiàn)自發(fā)激活，進(jìn)入結(jié)核急性感染狀態(tài)，則說明該模型并非處于LTBI狀態(tài)[10,12,27]。

驗(yàn)證非人靈長類LTBI模型，最終尸檢時肺部病理進(jìn)一步支持上述臨床評估指標(biāo)分類方案的有效性，LTBI的非人靈長類模型中病變范圍更局限，甚至無肉眼可見的肺部病變，只有淋巴結(jié)受累。肺葉及淋巴結(jié)中的細(xì)菌負(fù)荷量比活動性結(jié)核病者更低[55]。

5 目前存在的挑戰(zhàn)

哺乳動物的LTBI模型普遍面臨實(shí)驗(yàn)周期長、費(fèi)用昂貴、需要使用動物高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室等諸多問題。此外，主要通過離體檢測組織器官中菌落數(shù)量、病理改變(如肉芽腫數(shù)目、大小、結(jié)構(gòu)改變等)、炎癥因子和細(xì)胞因子的改變等區(qū)分活動性結(jié)核病及LTBI狀態(tài)。該檢測需要在幾個不同的時間點(diǎn)處死動物，分離器官，需要大量的實(shí)驗(yàn)動物。每個時間點(diǎn)處死不同的動物，無法評估同一動物疾病狀態(tài)的變化，且結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，常在4周后才能獲得結(jié)果，使得相關(guān)研究周期較長。另外，動物高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室對于硬件設(shè)施和實(shí)驗(yàn)操作人員的專業(yè)性要求均較高，而且LTBI模型相關(guān)研究周期長，國內(nèi)很少有團(tuán)隊(duì)具備硬件條件和資金開展系統(tǒng)性的研究工作。

然而，科技的進(jìn)步和多學(xué)科的交融也促進(jìn)了LTBI模型相關(guān)的研究。越來越多的先進(jìn)技術(shù)如無創(chuàng)的磁共振成像(MRI)、18氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET/CT)[56-57]和靶向巨噬細(xì)胞的放射性碘標(biāo)記DPA-713(125I-DPA-713)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(SPECT/CT)等[58]，被用于監(jiān)測結(jié)核病的病程發(fā)展。這些無創(chuàng)、非侵入性的操作，所需動物更少，極大地促進(jìn)了對于費(fèi)用昂貴的非人靈長類LTBI模型的研究。無創(chuàng)操作還可在不同時間點(diǎn)連續(xù)評估同一動物的疾病狀態(tài)變化，減少個體差異帶來的誤差。感染劑量的差異及非人靈長類動物個體間的差異，導(dǎo)致傳統(tǒng)的檢測手段很難確定每個動物個體的復(fù)發(fā)的時間，而成像技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用則為解決此類問題提供了很好的思路。

6 結(jié)語

目前，因宿主易感性的差異，老年人、兒童、免疫缺陷患者[原發(fā)性免疫缺陷和繼發(fā)性免疫缺陷(HIV感染者)]等感染M.tb的表現(xiàn)有諸多差異。因此，全面認(rèn)識M.tb感染，判斷M.tb感染后所處的疾病狀態(tài)，了解結(jié)核再復(fù)發(fā)的機(jī)制，開發(fā)新的抗結(jié)核藥物及疫苗迫在眉睫，而標(biāo)準(zhǔn)化的動物模型、快速準(zhǔn)確的評價方式在研究中具有關(guān)鍵作用。