董科迪，朱淵，鄧奇峰，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123

細胞死亡是機體在生理環(huán)境下胚胎發(fā)育和組織更新過程中的正?，F(xiàn)象，但當受到一些外界刺激后也是應(yīng)對損傷的一種病理反應(yīng)。細胞死亡可分為意外細胞死亡(accidental cell death，ACD)和調(diào)節(jié)性細胞死亡(regulated cell death，RCD)，其中發(fā)生在生理條件下的RCD也被稱為程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)。ACD是一種極端的物理、化學或機械因素引起細胞質(zhì)膜破裂，幾乎是瞬間發(fā)生的不可逆細胞死亡形式；RCD則是涉及多種效應(yīng)分子參與的可調(diào)控信號級聯(lián)反應(yīng)。細胞凋亡(apoptosis)是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主死亡。早期研究認為只有凋亡才受到特定程序調(diào)控，將細胞凋亡的概念錯誤地等同于PCD，以區(qū)分于當時細胞壞死的概念，即ACD[1-2]。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)并定義了多種呈現(xiàn)壞死形態(tài)的RCD，如焦亡、壞死性凋亡、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)依賴性程序性細胞死亡和鐵死亡等[3]。

壞死性凋亡的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1988年，Laster等[4]發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)不僅可以誘導細胞凋亡還可以導致細胞發(fā)生壞死。此后其他研究者經(jīng)過大量篩選成功地用小分子化合物干預了TNF誘導的細胞壞死，表明這種細胞死亡方式是可以被誘導和調(diào)控的，曾用“programmed necrosis”(程序性凋亡)描述這種細胞死亡方式[5]。2012年細胞死亡命名委員會(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)將其正式命名為necroptosis(壞死性凋亡)[6]。目前研究表明，壞死性凋亡在生理和病理條件下均可發(fā)生，如胚胎發(fā)育、急性腎損傷、心臟缺血/再灌注、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和微生物感染等[7-8]。隨著細胞死亡研究的深入，揭示了細菌侵入機體后引起的組織損傷和細胞壞死這一過程有多種RCD的參與。細胞的生死結(jié)局受到細菌和宿主兩者相互作用的調(diào)控，決定感染進程和感染性疾病的結(jié)局。壞死性凋亡作為新發(fā)現(xiàn)的RCD之一，其在細菌感染領(lǐng)域的作用正逐步被揭開。本綜述針對該方面的研究進展進行總結(jié)，期望為該領(lǐng)域的研究者提供參考資料。

1 壞死性凋亡(necroptosis)

壞死性凋亡是由絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白(receptor interacting protein/receptor-interacting protein kinase，RIP/RIPK)調(diào)控的RCD。凋亡作為最早被發(fā)現(xiàn)和定義的RCD，其形態(tài)學特征是細胞皺縮，核染色質(zhì)濃縮邊集，膜起泡并形成凋亡小體。而發(fā)生壞死性凋亡的細胞具有類似壞死細胞的形態(tài)，如細胞體積增大、細胞器腫脹和細胞膜穿孔，最后細胞崩解[9]。細胞崩解釋放胞漿內(nèi)容物，引起損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)——白介素1α(interleukin-1α，IL-1α)、親環(huán)蛋白A(cyclophilin A，CypA)、高遷移率族蛋白1(high-mobility group protein B1，HMGB1)、組蛋白、尿酸、ATP和線粒體DNA等釋放[10]。在DAMPs中，由于CypA在較早階段釋放，HMGB1在后期釋放，兩者常分別用作壞死性凋亡早期和晚期檢測的生物標記物[11]。DAMPs導致局部炎癥細胞募集，表現(xiàn)為大量炎癥細胞的浸潤和激活，因此壞死性凋亡通常被認為是一種炎性的細胞死亡方式[12]。相比之下，凋亡由于膜結(jié)構(gòu)相對完整而不引起機體顯著的炎癥反應(yīng)，是一種免疫沉默形式的細胞死亡[13]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡的后果不一定總是促炎的，也可通過消除產(chǎn)生細胞因子和炎性產(chǎn)物的細胞從而抑制炎癥反應(yīng)[14-15]。壞死性凋亡的啟動是在RIPK1和不依賴RIPK1的其他因素刺激下，通過激活RIPK3繼而由混合系列激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)參與的有序激活反應(yīng)。壞死性凋亡分為依賴RIPK1的經(jīng)典途徑和不依賴RIPK1的非經(jīng)典途徑，可由TNF、FasL、干擾素(interferons，IFNs) 等細胞因子以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)等病原微生物成分觸發(fā)相關(guān)信號傳導級聯(lián)反應(yīng)。

1.1 依賴RIPK1的經(jīng)典途徑

凋亡是依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族介導的級聯(lián)反應(yīng)。caspase-8作為一個分子開關(guān)調(diào)控凋亡和壞死性凋亡等細胞死亡之間的平衡，其酶活性和蛋白支架功能決定著細胞執(zhí)行死亡的方式[16]。TNF引起的腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)信號轉(zhuǎn)導途徑與細胞凋亡相關(guān)；但在caspase-8酶活性受抑制時也可誘導依賴RIPK1的壞死性凋亡[17]。經(jīng)典的壞死性凋亡途徑是RIPK1磷酸化后通過其RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)與RIPK3作用，隨后由RIPK3自磷酸化和激活，與RIPK1實現(xiàn)穩(wěn)定的寡聚形成壞死小體(necrosome)[18]?；罨蟮腞IPK3通過募集并磷酸化MLKL使其發(fā)生構(gòu)象改變。MLKL寡聚化后被轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上形成孔道致膜破裂，最終引發(fā)細胞死亡。除較早發(fā)現(xiàn)的TNFR1受體外，其他同屬于TNFR超家族的死亡受體，如TNF相關(guān)的凋亡誘導配體受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAILR)和Fas等也可引起經(jīng)典途徑的壞死性凋亡[19]。

1.2 不依賴RIPK1的非經(jīng)典途徑

非經(jīng)典途徑是指在不依賴RIPK1的其他因素刺激下引發(fā)的壞死性凋亡。除RIPK1外其他含有RHIM的分子，包括干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)和DNA依賴性干擾素調(diào)節(jié)因子激活劑(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)，它們也可通過其結(jié)構(gòu)域與RIPK3相互作用引發(fā)下游事件，最終導致細胞發(fā)生壞死性凋亡。DAI也稱為Z-DNA結(jié)合蛋白1 (Z-DNA binding protein 1，ZBP1)，在干擾素受體(interferon receptor，IFNR)信號、病毒和細胞內(nèi)源性左旋形態(tài)的核酸(Z-nucleic-acid)刺激下，可直接激活RIPK3觸發(fā)DAI-RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡[20-22]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)可以誘導TRIF-RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡，如細菌LPS和內(nèi)體(endosome)中的dsRNA分別激活TLR3和TLR4后，通過TRIF進行RHIM依賴性相互作用激活RIPK3[23]。

依賴RIPK1和不依賴RIPK1的壞死性凋亡途徑如圖1所示。

圖1 依賴RIPK1和不依賴RIPK1的壞死性凋亡途徑

2 細菌感染與細胞壞死性凋亡

細菌與宿主的相互作用，以及感染與機體抗感染免疫的相生相克，處于不斷發(fā)生動態(tài)變化和平衡的狀態(tài)。一方面細菌侵入機體后引起宿主組織和細胞的損傷，通過操縱細胞生死促進自身播散及免疫逃逸；另一方面宿主通過調(diào)節(jié)自身細胞死亡來清除受感染的細胞和觸發(fā)抗感染免疫。病原微生物感染過程中存在多種細胞死亡方式，其中之一是壞死性凋亡。敲除壞死性凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白RIPK3或MLKL基因的小鼠在生理條件下均未見病理改變，但在感染過程中有不同于野生型小鼠的表型，如存活率、組織病變程度和細菌載量等[24]。

2.1 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)

MRSA是臨床上常見的毒性較強的化膿性細菌，主要通過接觸傳播引起皮膚感染，在某些情況下通過血流擴散至其他組織和臟器引起膿毒血癥。MRSA入侵宿主后，中性粒細胞作為重要的固有免疫細胞最早吞噬病原菌。2014年Greenlee-Wacker等[25]首次報道了吞噬體內(nèi)的MRSA誘發(fā)中性粒細胞壞死性凋亡。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中外毒素，如α溶血素(α-hemolysin，Hla)、多種白細胞毒素——LukAB與 PSMα等均可引起壞死性凋亡，是肺部炎癥性壞死的主要因素。在體外巨噬細胞感染模型中，證實通過抑制RIPK1或MLKL信號傳導及應(yīng)用毒素突變株感染均可減少細胞死亡[26]。金黃色葡菌球菌染色體上編碼的附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)系統(tǒng)參與多種毒力因子的表達調(diào)控，包括Hla、LukAB和 PSMα等外毒素。2018年Zhou等[27]以毒力因子調(diào)控系統(tǒng)為靶點，通過使用agr抑制劑減輕了MRSA感染過程中壞死性凋亡所致的小鼠肺炎。然而，在感染過程中壞死性凋亡對宿主組織器官造成損傷的同時也可減輕病原菌引起的病理性炎癥反應(yīng)。在皮膚感染和敗血癥模型中，Kitur等[28]觀察到Mlkl基因敲除小鼠和使用RIPK1或RIPK3抑制劑干預的小鼠體內(nèi)細菌負荷增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡通過限制MRSA誘導的過度炎癥從而有利于機體維持對病原菌的清除功能。

2.2 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)

Mtb是引起人類結(jié)核病的病原體，主要通過飛沫傳播，以肺部感染多見，也可侵犯全身各器官系統(tǒng)。Mtb具有逃逸宿主免疫反應(yīng)并在健康個體中持續(xù)存在的能力。Mtb能抑制巨噬細胞凋亡同時引發(fā)細胞壞死，以延遲由凋亡觸發(fā)的適應(yīng)性免疫和通過使巨噬細胞壞死以逃避固有免疫[29]。Lalita課題組在斑馬魚感染模型中發(fā)現(xiàn)，感染的巨噬細胞TNF信號被激活，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)介導對病原菌的抗性[30]；但增強巨噬細胞殺傷活性的同時，過量的TNF會使巨噬細胞發(fā)生經(jīng)典途徑的壞死性凋亡，并將細菌釋放到胞外有利于其生長的環(huán)境中[31]。Mtb感染也可引起人或小鼠巨噬細胞死亡，但與之前斑馬魚模型中Mtb引起壞死性凋亡有所不同，這一過程僅依賴RIPK3介導的線粒體功能障礙觸發(fā)細胞壞死，而與RIPK1無關(guān)[32]。Stutz等[33]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與此相符，他們通過敲除MLKL的基因或使用RIPK1抑制劑，未能對感染的人或小鼠巨噬細胞死亡產(chǎn)生影響；經(jīng)移植人的胚胎胸腺和造血干細胞后，具有人類固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的小鼠——免疫系統(tǒng)人源化小鼠感染結(jié)局也未發(fā)生改變。表明Mtb感染過程中壞死性凋亡信號傳導被阻斷，對宿主而言有利于減輕壞死性凋亡在結(jié)核病中引發(fā)的病理性損傷。

2.3 非傷寒沙門菌(non-typhoidal Salmonella，NTS)

NTS是主要的引起食源性腹瀉的革蘭陰性兼性胞內(nèi)菌，引起人類和動物的沙門菌病。人感染后可發(fā)生急性胃腸炎，在免疫功能低下人群中還可導致腸道外侵襲性感染。機體的消化道腸上皮細胞作為腸黏膜屏障的重要組成部分，是抵抗病原菌侵入的門戶。有研究表明，在鼠傷寒沙門菌引起腸炎過程中，壞死性凋亡抑制蛋白caspase-8可以防止腸上皮細胞壞死性凋亡發(fā)生，維持腸屏障功能以抵御病原菌入侵[34]。另外Hu等[35]發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌分泌蛋白B(Salmonellaouter protein B，SopB)通過調(diào)控腸上皮細胞壞死性凋亡有助于細菌從胞內(nèi)釋放并播散。沙門菌突破腸黏膜上皮屏障后主要遭遇巨噬細胞的吞噬和殺傷。有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，I型干擾素(type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ)受體缺陷小鼠感染鼠傷寒沙門菌后存活率更高，細菌利用宿主IFN-Ⅰ誘導巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡，從而逃避固有免疫反應(yīng)[36-37]。另外，Young-Tae等[38]在巨噬細胞模型中發(fā)現(xiàn)，沙門菌感染過程中microRNA-155上調(diào)，靶向RIPK1和RIPK3促進巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡。由此可見腸上皮細胞和巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡有助于沙門菌播散和免疫逃逸。

2.4 單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)

Lm是一種自然界廣泛分布的食源性致病革蘭陽性菌。該菌可耐低溫生長繁殖，常存在于冷藏食品中威脅人類健康。細菌通過機體消化道穿過腸屏障，經(jīng)血到達肝脾乃至中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤，引起敗血癥、急性肝損傷、腦膜炎和胎兒死亡等。體外巨噬細胞感染模型發(fā)現(xiàn)，李斯特菌成孔毒素(listeriolysin-O，LLO)可導致細胞發(fā)生壞死性凋亡[39]。小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)，Lm可引起肝臟枯否細胞(Kupffer cells，KCs)發(fā)生壞死性凋亡，KCs的死亡隨即招募單核細胞增殖分化為新的KCs替代死亡細胞和引發(fā)抗菌炎癥反應(yīng)[40]。雖然宿主可通過壞死性凋亡觸發(fā)自我修復和抗菌反應(yīng)，但這種死亡方式也導致肝損傷。Qian等[41]發(fā)現(xiàn)，Ripk1基因敲除小鼠可以通過減輕肝組織細胞壞死性凋亡、炎癥和線粒體功能障礙等，從而緩解Lm引起的肝損傷。最近還有研究者發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡執(zhí)行蛋白MLKL激活后不引起細胞壞死性凋亡，而是直接結(jié)合胞內(nèi)Lm對其殺傷，說明在某些情況下宿主具有非依賴細胞死亡殺傷機制，是抵御外來病原菌的另一種防御策略[42]。

2.5 鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis，Yp)

Yp是烈性傳染病鼠疫的病原菌，曾引起中世紀歐洲的“黑死病”，人與嚙齒類感染動物接觸或通過鼠蚤感染。細菌侵入機體后被巨噬細胞吞噬，在細胞內(nèi)繁殖并沿淋巴管到達局部淋巴結(jié)，引起出血壞死性淋巴結(jié)炎，繼而引發(fā)敗血癥。RIPK1作為激酶活化后可誘導細胞凋亡或壞死性凋亡[43]。Dan等[44]報道Yp可通過RIPK1、caspase-8和RIPK3導致凋亡和壞死性凋亡兩種巨噬細胞死亡方式。在耶爾森菌感染過程中，依賴RIPK1的巨噬細胞凋亡促進細胞因子產(chǎn)生和抗菌反應(yīng)從而有利于宿主抵抗病原菌[45]。壞死性凋亡的作用與凋亡相反，研究報道Yp外膜蛋白(Yersiniaouter protein J，YopJ)引起的巨噬細胞死亡可促進鄰近細胞感染，同時檢測到壞死小體形成以及磷酸化MLKL上調(diào)，證實了巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡。通過小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞壞死性凋亡有利于Yp從胞內(nèi)釋放并在腹股溝淋巴結(jié)中播散[46]。

3 結(jié)語

壞死性凋亡對機體而言是一把“雙刃劍”，既作為一種細胞死亡方式，又是宿主免疫防御的重要組成部分；對病原菌而言，其作用隨感染的種類、入侵途徑、菌量和時相等多種因素而異。壞死性凋亡的雙重機制在抗感染時具有不同效應(yīng)：一方面影響細菌引起的炎癥、觸發(fā)宿主自我修復和抗菌反應(yīng)以清除病原菌；另一方面加重感染導致的病理性損傷和促進胞內(nèi)菌釋放播散。進一步探索壞死性凋亡機制及其相關(guān)蛋白的功能，以及與各種細胞死亡方式之間的關(guān)系，對認識和揭示感染性疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。