宋潔玉，單璞，李樹香，仇超，徐靜，汪萱怡, 3，聞玉梅

1. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院暨教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實驗室，上海 200032； 2. 國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京 101111；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所導(dǎo)致的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是一個全球性公共衛(wèi)生問題, 多年來一直嚴(yán)重影響我國人民健康。自1985年血源預(yù)防性HBV疫苗進(jìn)入中國，其后酵母重組HBV疫苗被引進(jìn)，經(jīng)過30年的努力，到2014年我國15歲以下人群中HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)流行率從10%下降到<1%[1]，一般人群中乙型肝炎流行率約為5%，由此推算慢性HBV感染者約有 7 000 萬例，其中CHB患者高達(dá)2 000～3 000 萬例[2]，因此我國實現(xiàn)消除乙型肝炎的目標(biāo)依然任重道遠(yuǎn)。

HBV感染人體后，在其生命周期中形成共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，是高度穩(wěn)定的病毒復(fù)制模板。目前臨床使用的抗病毒藥物，無論是核苷(酸)類似物還是聚乙二醇干擾素α(polyethylene glycol interferon α，Peg-IFN-α)均無法有效清除cccDNA。近年來，繼實現(xiàn)長期抑制HBV復(fù)制和HBV e抗原(HBV e antigen，HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，全球各CHB防治指南均提出“功能性治愈”(functional cure)的概念，即經(jīng)過治療達(dá)到血清HBsAg消失。遺憾的是，現(xiàn)有抗病毒治療長期使用后僅極少數(shù)患者(5%～13%)能實現(xiàn)HBsAg轉(zhuǎn)陰[3]。因此，目標(biāo)HBV生命周期的多個靶點(diǎn)的新藥，特別是特異性清除HBV的治療性疫苗研究備受矚目。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，對既往臨床試驗中經(jīng)抗原抗體復(fù)合物型治療性HBV疫苗(乙克)治療后的 CHB患者HBsAg水平下降情況進(jìn)行歸納分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象與方法

目前臨床重視乙型肝炎的“功能性治愈”，因此本研究對乙克臨床試驗中患者血清HBsAg變化數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。自2005年始，乙克在HBeAg陽性的初治CHB患者中開展了多項Ⅱ期與Ⅲ期臨床試驗，本研究選擇研究方案相同的Ⅱb[4]與Ⅲb期臨床試驗中單用60 μg乙克或單用氫氧化鋁佐劑的受試者作為研究對象。

受試者均為未經(jīng)抗病毒藥物治療的CHB患者，需滿足以下條件：① HBsAg陽性持續(xù)6個月以上；② HBeAg陽性且乙型肝炎e抗體(hepatitis B e antibody，HBeAb) 陰性；③ HBV DNA≥105copies/mL；④血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)是正常值上限的2～10倍。將以上患者按1∶1比例隨機(jī)分配至乙克治療組或氫氧化鋁佐劑組，分別在第0(基線期)、4、8、12、16、20周時在上臂三角肌注射1劑試驗藥物，共計注射6劑，隨訪24周。在第0、4、8、12、16、20、24、32、44周采集血標(biāo)本，檢測肝功能(ALT)，血清送中心實驗室，用Abbott EIA AxSYM分析儀(Abbott，Abbott Park，IL，USA)檢測HBsAg(定量)、HBeAg及HBeAb，用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀定量檢測HBV DNA (PiJi，Shenzhen Co.；檢測下限為500 copies/mL)。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析

采用符合方案集(per protocol set，PPS)，定義為受試者符合入選和排除標(biāo)準(zhǔn)，完成至少5劑研究藥物注射，以及第0、4、8、12、16、20、44周的隨訪。HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換定義為血清HBeAg由陽性轉(zhuǎn)為陰性并出現(xiàn)HBeAb，ALT驟升(ALT flare)定義為ALT>400 IU/mL。

首先，比較Ⅱb和Ⅲb期臨床試驗數(shù)據(jù)合并后乙克治療組與氫氧化鋁佐劑組受試者的基線均衡性；然后，以HBsAg下降均值、HBsAg下降>0.5log10IU/mL及HBsAg下降>1.0log10IU/mL三個指標(biāo)比較乙克治療組與氫氧化鋁佐劑組之間第44周HBsAg的下降情況，并按HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換進(jìn)一步分層分析；最后，分析ALT flare與HBsAg下降的相關(guān)性。通過單因素分析和多因素Logistic回歸模型，分析可能影響第44周HBsAg下降的基線因素，并計算比值比(odds ratio，OR)及其95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)。使用SAS統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc.，NC，USA)，分類變量的分析采用卡方檢驗或Fisher精確法檢驗，連續(xù)型變量的分析采用t檢驗，對HBV DNA、HBsAg定量及HBeAg半定量數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的組成與基線均衡性

Ⅱb期臨床試驗中，60 μg乙克組與氫氧化鋁佐劑組各入組78例CHB患者，評估后符合方案者均為70例(89.7%)(P>0.05)；Ⅲb期臨床試驗中，60 μg乙克組與氫氧化鋁佐劑組分別入組140例與137例CHB患者，其中符合方案者分別為106例(75.7%)與112例(81.8%)(P>0.05)。Ⅱb和Ⅲb期臨床試驗數(shù)據(jù)合并后，乙克組與氫氧化鋁佐劑組之間患者年齡、性別、傳播途徑、HBV基因型，以及基線ALT、HBsAg、HBV DNA和HBeAg水平均無統(tǒng)計學(xué)差異，均衡性較好(見表1)。

表1 Ⅱb期與Ⅲb期臨床試驗中慢性乙型肝炎受試者的基線特征

Ⅱb與Ⅲb期臨床試驗的主要療效終點(diǎn)均為HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，其中Ⅱb期乙克治療后24.3%患者(17例)達(dá)到終點(diǎn)，氫氧化鋁佐劑組為11.4%(8例)(P<0.05)；Ⅲb期乙克治療后13.2%患者(14例)達(dá)到終點(diǎn)，氫氧化鋁佐劑組為13.4%(15例)(P>0.05)；Ⅱb和Ⅲb期臨床試驗數(shù)據(jù)合并后乙克治療組有17.6%患者(31例)達(dá)到終點(diǎn)，氫氧化鋁佐劑組為12.6%(23例)(P>0.05)。

2.2 隨訪結(jié)束時HBsAg下降情況

治療結(jié)束后隨訪6個月至隨訪結(jié)束(第44周)，乙克組與氫氧化鋁佐劑組HBsAg下降幅度相當(dāng)，約為0.4log10IU/mL(P=0.40)。然而，乙克組中達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者HBsAg下降十分明顯，為0.95log10IU/mL，顯著高于未達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者(0.32log10IU/mL)(P<0.01)；氫氧化鋁佐劑組中達(dá)到與未達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者HBsAg分別下降0.49log10IU/mL與0.36log10IU/mL(P=0.34)。進(jìn)一步分析HBsAg下降>1.0log10IU/mL的受試者，乙克組達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者中有38.71%(12/31)患者HBsAg下降達(dá)到這一幅度，最大者下降4.98log10IU/mL，從而實現(xiàn)了HBsAg清除，而氫氧化鋁組僅13.04%(3/23)患者HBsAg下降達(dá)到這一幅度(P=0.03)(見表2)。

表2 隨訪結(jié)束時HBsAg下降情況

2.3 治療與隨訪期間ALT flare與HBsAg下降情況

在治療與隨訪期間，分別有80例(22.3%)與23例(6.4%)受試者發(fā)生了ALT flare(P<0.000 1)。無論是治療期[乙克組42例(23.9%)，氫氧化鋁組38例(20.9%)(P=0.49)]還是隨訪期[乙克組11例(6.3%)，氫氧化鋁組12例(6.6%)(P=0.89)]，乙克組與氫氧化鋁組的ALT flare發(fā)生率相仿。乙克組在第44周HBsAg下降>1.0log10IU/mL的受試者中，約半數(shù)(14/30，46.7%)在治療期間發(fā)生了ALT flare；而HBsAg下降≤1.0log10IU/mL的受試者中，僅19.2%(28/146)發(fā)生了ALT flare(P=0.001 3)。氫氧化鋁組中，第44周HBsAg下降>1.0log10IU/mL者與HBsAg下降≤1.0log10IU/mL者之間ALT flare發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異(5/21，23.8%；33/161，20.5%；P=0.73)(見表3)。

表3 治療期與隨訪期ALT驟升與HBsAg下降的關(guān)系

2.4 影響HBsAg下降的因素

將受試者的年齡、性別、感染的HBV基因型，基線ALT、HBeAg、HBsAg、HBV DNA水平，以及治療與隨訪期間ALT flare發(fā)生與否均納入Logistic回歸模型，變量納入與剔除均以0.15為檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果顯示，影響患者第44周HBsAg下降是否>1.0log10IU/mL的因素依次為基線HBsAg水平、第44周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、治療期間發(fā)生ALT flare及HBV基因型(見表4)。其中，除HBV基因型對HBsAg下降的影響接近統(tǒng)計學(xué)顯著水平，其余三項的影響均十分顯著。

表4 隨訪結(jié)束時HBsAg下降的影響因素

3 討論

目前，對CHB患者采用抗病毒治療以延緩或減少肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生，改善生活質(zhì)量和延長生存時間已成為乙型肝炎防治共識。患者接受抗病毒治療的比例從2005年首版《慢性乙型肝炎防治指南》制訂時的19%逐漸上升到如今的幾乎100%。同時，抗病毒治療的療效終點(diǎn)也從HBV DNA的抑制發(fā)展為HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，再發(fā)展到“在部分適合條件的患者中追求臨床治愈”，即以HBsAg轉(zhuǎn)陰為特征的治療終點(diǎn)[5-7]。然而，采用現(xiàn)有核苷(酸)類似物治療CHB對患者血清HBsAg下降的作用甚微，血清HBsAg年轉(zhuǎn)陰率約為1.0% (95% CI：0.8～1.3)[8]。一般認(rèn)為，核苷(酸)類似物治療1年，HBsAg轉(zhuǎn)陰率僅為0～3%，其中替諾福韋療效相對為佳，清除率可達(dá)3%。即便是具有免疫調(diào)節(jié)作用的長效干擾素，其治療1年的HBsAg清除率亦僅為3%[8-9]。近期有研究報道，患者經(jīng)干擾素治療達(dá)到HBsAg轉(zhuǎn)陰停藥后，繼續(xù)隨訪26、52、78、104和597周，病毒學(xué)復(fù)發(fā)率分別為0.84%、6.29%、6.88%、8.18%和9.66%[10]。香港一項隊列研究表明，用恩替卡韋治療初治乙型肝炎患者5年，血清HBsAg平均年下降0.125log10IU/mL[11]。本研究對乙克的臨床研究資料進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)CHB患者經(jīng)乙克治療5個月，隨訪6個月后其血清HBsAg下降達(dá)0.43log10IU/mL，明顯高于香港恩替卡韋治療隊列中的HBsAg年下降量。本研究中，經(jīng)乙克治療達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者的HBsAg下降更是高達(dá)0.95log10IU/mL。比較乙克組與氫氧化鋁組中達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換者，乙克組出現(xiàn)了明顯的血清HBsAg下降(乙克組0.95log10IU/mL，氫氧化鋁組0.49log10IU/mL)，提示患者經(jīng)乙克治療后血清HBsAg下降是特異性免疫治療的結(jié)果。乙克組治療過程中ALT flare在HBsAg下降>1.0log10IU/mL者中較多見，隨訪期間較少見(3/30，10.0%)，而氫氧化鋁組未觀察到此現(xiàn)象。CHB患者尤其是HBeAg陽性患者(治療或未經(jīng)治療)會發(fā)生ALT突發(fā)升高，這種突發(fā)升高往往是人類白細(xì)胞抗原1(human leukocyte antigen 1，HLA-1)限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的針對HBV特異性免疫反應(yīng)的結(jié)果，而ALT水平通常反映免疫反應(yīng)程度，因此更高的ALT水平代表對HBV更強(qiáng)的免疫清除，往往隨之發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBV DNA清除[12-14]。

本研究將乙克Ⅱb和Ⅲb期臨床試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了合并分析，發(fā)現(xiàn)與核苷(酸)類似物及干擾素類藥物治療后血清HBsAg下降的影響因素相似[11,15-16]，使用乙克治療后影響HBsAg下降的因素包括患者出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、感染的HBV為B基因型、治療過程中ALT出現(xiàn)10倍增高，以及基線血清HBsAg為高水平。

本研究結(jié)果顯示，乙克的特異性免疫對降低CHB患者血清HBsAg有一定效果，提示今后治療CHB除采用抗病毒核苷(酸)類藥物作為基礎(chǔ)用藥外，可有計劃地應(yīng)用乙克激活特異免疫，或采用“抗病毒藥物治療+針對HBsAg的中和性抗體被動免疫+乙克主動免疫”的“三明治”治療策略[17]，可能會更快達(dá)到“功能性治愈”的目的。