暢昶，鄧青，張勇峰

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽(yáng)471000

自20世紀(jì)70年代以來(lái)，全球乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，乳腺癌的防治成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。近些年來(lái)乳腺癌的病死率呈明顯下降趨勢(shì)，究其原因與乳腺癌早期篩查、綜合治療方法的開展等密切相關(guān)，盡管乳腺癌是目前療效最佳的實(shí)體瘤之一，但由于腫瘤異質(zhì)性以及病理特征的多樣性，導(dǎo)致患者預(yù)后不盡相同。研究表明，乳腺癌原發(fā)灶以及轉(zhuǎn)移灶間的分子標(biāo)志物表達(dá)水平存在明顯差異，臨床可根據(jù)此特征為乳腺癌后續(xù)治療方案的合理選擇提供重要參考。因此積極探究乳腺癌的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制，尋找特異性標(biāo)志物，可為乳腺癌的靶向治療提供參考，對(duì)提高乳腺癌患者的臨床治療效果具有積極意義。驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白（kinesin-like DNA binding protein，KNSL4）自首次從人乳腺癌細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究證實(shí)其具有微管驅(qū)動(dòng)功能和轉(zhuǎn)錄因子功能，與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。自國(guó)外學(xué)者首次從人肺癌細(xì)胞中分離出轉(zhuǎn)化基因ras以來(lái)，研究表明ras基因與肺癌、大腸癌以及胰腺癌等發(fā)生有關(guān)，且52%的肺腺癌存在ras基因突變。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ras基因突變產(chǎn)物p21ras基因與惡性腫瘤發(fā)病和惡性生物學(xué)行為關(guān)系的研究成為關(guān)注焦點(diǎn)。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與KNSL4、p21ras基因關(guān)系的研究尚處于初步探索階段，基于此本文展開臨床研究，旨在為乳腺癌的早期診治提供重要參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院行乳腺切除術(shù)的乳腺癌患者的臨床資料和隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》中有關(guān)乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)檢查確診；臨床資料及隨訪資料完善；術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類型惡性腫瘤；處于特殊時(shí)期（如哺乳期、妊娠期等）；合并嚴(yán)重內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。淮嬖谀δ墚惓?；術(shù)前檢查存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入82例乳腺癌患者，年齡35～56歲，平均（46.01±4.06）歲；TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期38例，Ⅲ期18例；病理分型：鱗狀細(xì)胞癌8例，腺癌74例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽(yáng)性48例，陰性34例；分化程度：低分化16例，中分化39例，高分化27例。收集82例乳腺癌患者石蠟包埋的乳腺癌組織及其癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)KNSL 4、 p21ras表達(dá)情況及結(jié)果判定

收集乳腺癌組織及其癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均采用超敏鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒（購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）進(jìn)行染色，二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)（共修復(fù)20 min）。滴加一抗（購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，配制方法：采用磷酸鹽緩沖液按1∶150比例將KNSL4或p21ras單克隆抗體稀釋），4℃孵育過(guò)夜，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min，滴加二抗（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃孵育30 min，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min。二甲基聯(lián)苯胺液顯色，蒸餾水沖洗，明礬蘇木素復(fù)染，0.2%鹽酸分化，再進(jìn)行乙醇脫水和二甲苯透明及中性樹脂封片，最后于光學(xué)顯微鏡下觀察。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，KNSL4、p21ras陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀，均位于細(xì)胞核內(nèi)，高倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)細(xì)胞數(shù)≥200個(gè)的視野。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分：未見陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占比≤10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞占比11%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞占比51%～80%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞占比＞80%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≥2分為陽(yáng)性，乘積≤1分為陰性。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerasechainreaction，RT-PCR）檢 測(cè)KNSL 4、 p21ras mRNA相對(duì)表達(dá)量

提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行三步法擴(kuò)增，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參基因，重復(fù)測(cè)量3次取平均Ct值。采用2法計(jì)算KNSL4、p21ras mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=C（t目的基因）-C（t內(nèi)參基因），ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)KNSL 4、p 21ras蛋白相對(duì)表達(dá)量

收集KNSL4、p21ras蛋白樣品，檢測(cè)蛋白樣品的濃度并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），在蛋白樣品中滴加SDSPAGE蛋白緩沖液，100℃沸水加熱，蛋白完全變性并冷卻后，室溫中將蛋白樣品直接上樣到SDSPAGE凝膠孔中，添加SDS-PAGE電泳液進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠孔底端附近時(shí)停止電泳，對(duì)轉(zhuǎn)膜成功的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，隨后將蛋白膜置于備好的洗滌液中漂洗，經(jīng)一抗以及二抗孵育后，回收二抗，添加洗滌液，共3次，采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin蛋白為內(nèi)參物。

1.5 觀察指標(biāo)

①乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL4、p21ras的表達(dá)情況。②不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4、p21ras的表達(dá)情況。③依據(jù)術(shù)后6個(gè)月隨訪結(jié)果將患者分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（

n

=48）、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組（

n

=34）。比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中

KNSL4

、

p21ras

mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL 4、 p21ras表達(dá)情況的比較

乳腺癌組織中KNSL4陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，p21ras陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 乳腺癌組織、癌旁組織中KNSL 4、 p21ras表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras表達(dá)情況的比較

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，而p21ras陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=7.259、8.524，

P

=0.007、0.004）。不同TNM分期、病理類型、分化程度、分子亞型、腫瘤直徑的乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL4、p21ras陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中KNSL 4、p 21ras的表達(dá)情況（ n=82）

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中

KNSL4

mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，而

p21ras

mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表 3）

表3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

2.4 乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與KNSL 4、 p21ras表達(dá)量的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與KNSL4表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.653，

P

＜0.01），但與p21ras表達(dá)量呈正相關(guān)（

r

=0.608，

P

＜0.01）。

3 討論

隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為認(rèn)識(shí)的不斷深入，臨床對(duì)乳腺癌的治療理念逐步進(jìn)入綜合治療時(shí)代。盡管如此，目前中國(guó)女性乳腺癌病死率正以每年3%的速度增長(zhǎng)，如何有效降低乳腺癌發(fā)病率和病死率成為臨床關(guān)注焦點(diǎn)。研究表明，乳腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者病死率高的關(guān)鍵，而早期有效預(yù)測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是提高患者生存率和改善預(yù)后的關(guān)鍵。乳腺癌發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，研究表明腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和惡化與多種癌基因、抑癌基因失活密切相關(guān)，任何一種產(chǎn)物異常表達(dá)，如某種癌基因過(guò)度表達(dá)或某種抑癌基因失活，均會(huì)引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控以及腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。近年來(lái)KNSL4、p21ras基因與多種腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究時(shí)有報(bào)道，KNSL4、p21ras被證實(shí)與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。因此積極探究乳腺癌轉(zhuǎn)移與KNSL4、p21ras基因的關(guān)系，或可為乳腺癌及時(shí)有效治療提供參考。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中KNSL4陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，p21ras陽(yáng)性表達(dá)率則明顯高于癌旁組織，表明KNSL4、p21ras基因可能參與乳腺癌發(fā)生，其中KNSL4在乳腺癌組織中呈明顯下調(diào)趨勢(shì)而p21ras則呈明顯升高趨勢(shì)。最初KNSL4基因是作為一種驅(qū)動(dòng)蛋白基因，主要參與染色體運(yùn)動(dòng)、分配和紡錘體聚集等生物學(xué)行為。但萬(wàn)艷芳的研究指出KNSL4基因表達(dá)與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并證實(shí)了通過(guò)沉默乳腺癌細(xì)胞中KNSL4基因可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，間接說(shuō)明KNSL4基因或是惡性腫瘤的一種抑癌基因。而本研究結(jié)果則證實(shí)乳腺癌組織中KNSL4陽(yáng)性表達(dá)率明顯下調(diào)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中KNSL4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，相關(guān)性分析提示乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與KNSL4表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，由此推測(cè)KNSL4可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，從而降低乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤新生血管在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中具有重要作用，此外，細(xì)胞失控性增生也是腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。相關(guān)研究證實(shí)，KNSL4基因在腫瘤新生血管及細(xì)胞失控性增生中具有重要調(diào)節(jié)作用，故認(rèn)為KNSL4參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)腫瘤新生血管及細(xì)胞失控性增生有關(guān)。但本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌TNM分期、分化程度與KNSL4基因表達(dá)的相關(guān)性，與上述萬(wàn)艷芳的研究結(jié)果不同，可能與本研究對(duì)象來(lái)源較為集中或樣本量較小所致結(jié)果存在一定偏倚有關(guān)。

ras基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，其作用機(jī)制與ras基因突變產(chǎn)生的活化編碼產(chǎn)物p21ras蛋白表達(dá)量升高密切相關(guān)，p21ras位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在傳遞細(xì)胞生長(zhǎng)分化信號(hào)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究指出，野生型p21ras在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，p21ras基因參與直腸癌病理過(guò)程。而本研究則證實(shí)乳腺癌組織中p21ras陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織中p21ras陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，而進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與p21ras表達(dá)量呈正相關(guān)，說(shuō)明p21ras作為一種癌基因，參與乳腺癌轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。ras基因激活后成為癌基因，研究表明其基因突變形成產(chǎn)物p21ras后，與二磷酸鳥苷的結(jié)合能力降低，此時(shí)ras蛋白內(nèi)在的綠色熒光蛋白酶活性也降低，使得ras蛋白以及綠色熒光蛋白酶解離減少，最終腫瘤細(xì)胞因失去二磷酸鳥苷與綠色熒光蛋白酶有節(jié)制的調(diào)節(jié)而不可控制地增殖、惡變，故而認(rèn)為p21ras基因與乳腺癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

綜上所述，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與KNSL4、p21ras基因表達(dá)密切相關(guān)，KNSL4、p21ras可作為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一種有效預(yù)測(cè)標(biāo)志物。