尹逗逗 方銀軍 劉雪鋒

(1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214000；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州，310030)

氨基酸表面活性劑是一類以可再生物質(zhì)為原料的環(huán)境友好型表面活性劑，具有低毒、易生物降解的優(yōu)點(diǎn)[1-3]，且皮膚刺激性小[4-5]，配伍性能好[6-8]，與脂肪酸皂相比具有更好的硬水穩(wěn)定性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于日用化學(xué)品配方中[9-12]。工業(yè)上大多以肖頓-鮑曼縮合法合成氨基酸表面活性劑[13-15]，生產(chǎn)過(guò)程中難以避免酰氯的水解，而產(chǎn)物純度對(duì)應(yīng)用性能有直接的影響，因此，建立其純度分析方法對(duì)氨基酸表面活性劑的品質(zhì)控制和應(yīng)用具有重要的意義。

陰離子型的氨基酸表面活性劑在分子結(jié)構(gòu)上與脂肪酸相近，屬于羧酸類化合物，須在堿性條件下才能抑制水解。為確保滴定的準(zhǔn)確性，應(yīng)選擇適用于堿性條件的指示劑滴定。似乎可以采用適用于皂類表面活性劑的溴甲酚綠堿性兩相滴定法[16-17]進(jìn)行陰離子型氨基酸表面活性劑的定量分析。本文以N-月桂?；K氨酸(C12Thr)為例，對(duì)其進(jìn)行溴甲酚綠兩相滴定法純度分析。在滴定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乳化嚴(yán)重、破乳困難，嚴(yán)重干擾了滴定終點(diǎn)的判斷。進(jìn)而，采用高效液相色譜(HPLC)法(示差折光檢測(cè)器)對(duì)C12Thr樣品進(jìn)行了定量分析。相比兩相滴定法，HPLC法更為直觀、快速和簡(jiǎn)便。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-月桂?；K氨酸，自制；溴甲酚綠，AR，上海化學(xué)試劑總廠試劑三廠；十二水磷酸氫二鈉，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水磷酸鈉，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海明1622，97 %，北京伊諾凱科技有限公司；甲醇，HPLC，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；月桂酸，RG (99%以上)，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司。Agilent 1100型高效液相色譜儀 (示差折光檢測(cè)器) ，美國(guó)安捷倫公司；KQ-100B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩相滴定分析

分別以海明1622和CTAB(濃度均為4.00×10-3mol·L-1)為滴定劑、以溴甲酚綠為指示劑進(jìn)行兩相滴定分析[16-17]。預(yù)先用NaOH中和C12Thr得到N-月桂?；K氨酸鈉(C12ThrNa)試樣，配制100 mL 1.00×10-2mol·L-1的試液溶液。移取10 mL試樣溶液于100 mL具塞量筒中，并向其加入指示劑25 mL、氯仿15 mL和1.00 mol·L-1NaOH溶液1 mL，滴定間隙劇烈振搖，滴定過(guò)程中上層藍(lán)色開(kāi)始轉(zhuǎn)移至下層，記錄所加滴定劑的體積V1；放慢滴加速度至上層藍(lán)色完全轉(zhuǎn)移至下層時(shí)，記錄所加滴定劑的體積V2；繼續(xù)滴定至兩相立即破乳，記錄所加滴定劑的體積V3。平行滴定3次，取平均值?？瞻讓?shí)驗(yàn)可觀察到兩相立即破乳，藍(lán)色快速完全轉(zhuǎn)移至油相，記錄所加滴定劑的體積V0。

試樣中陰離子表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)x為：

式中，c為陽(yáng)離子滴定劑的濃度(mol·L-1)，Vi分別為V1、V2和V3，其中，V1為滴定過(guò)程中油相出現(xiàn)藍(lán) 色時(shí)滴定劑的體積(mL)，V2為滴定過(guò)程中上層藍(lán)色完全轉(zhuǎn)移至下層時(shí)滴定劑的體積(mL)，V3為兩相立即破乳時(shí)滴定劑的體積(mL)，V0為空白實(shí)驗(yàn)所消耗的滴定劑體積(mL)，M為待測(cè)表面活性劑的摩爾質(zhì)量(g·mol-1)，m為待測(cè)表面活性劑的質(zhì)量 (g)。

1.2.2 HPLC分析

(1) 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18反相柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：甲醇 (超聲脫氣) ；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：40 μL。該色譜條件下可實(shí)現(xiàn)C12Thr和LA兩者之間基線分離。

(2) C12Thr和LA的工作曲線和最低檢測(cè)限

以色譜甲醇為溶劑分別配制一系列不同濃度的C12Thr和LA溶液，得到色譜流出曲線，繪制C12Thr和LA的色譜峰面積(A)與濃度(c, g·L-1)關(guān)系圖，確定線性范圍[18-19]。將試樣溶液按梯度稀釋，將S/N(信噪比) = 3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢測(cè)限[20]。

(3) 精密度和空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取一定濃度的C12Thr和LA溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，并計(jì)算其 RSD 值。按照線性范圍內(nèi)低、中、高3種濃度，向空白樣品中加入待測(cè)物質(zhì)，每個(gè)樣品測(cè)3次，記錄峰面積，取平均值。

加標(biāo)回收率 ＝ 試樣測(cè)定值/理論值×100 %。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩相滴定

兩相滴定是根據(jù)兩相顏色變化來(lái)判斷滴定終點(diǎn)，進(jìn)而計(jì)算表面活性劑純度或含量的一種方法。在滴定過(guò)程中，滴定劑首先與待測(cè)物在水中發(fā)生定量化學(xué)反應(yīng)，形成難溶于水的陰陽(yáng)離子締合物進(jìn)入油相；達(dá)到等當(dāng)點(diǎn)后，過(guò)量的滴定劑與指示劑締合使水相顏色轉(zhuǎn)移至油相，即可判為滴定終點(diǎn)[16-17,21]。我們發(fā)現(xiàn)海明1622滴定C12ThrNa的過(guò)程中產(chǎn)生明顯的乳化現(xiàn)象(見(jiàn)圖1)。

分別在滴定至氯仿相剛出現(xiàn)藍(lán)色和水相顏色全部轉(zhuǎn)移至氯仿相時(shí)進(jìn)行了觀察，當(dāng)海明1622滴定至氯仿相剛出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)，乳化體系靜置 2.5 h后僅有少許油相析出（見(jiàn)圖1a），兩天后體系仍未完全破乳，此時(shí)C12ThrNa的滴定含量?jī)H約為76%（見(jiàn)表1）；繼續(xù)滴定至氯仿相顏色明顯加深、乳化層顏色明顯消退 (這個(gè)現(xiàn)象需要約17 h方可清楚觀察到，圖1b)，體系中的乳化現(xiàn)象依然嚴(yán)重，靜置48 h后才觀察到完全破乳，此時(shí)水相的藍(lán)色全部轉(zhuǎn)移至氯仿相（見(jiàn)圖1b），此時(shí)C12ThrNa的滴定含量約為90%（見(jiàn)表1）；繼續(xù)滴定至體系 1 min內(nèi)破乳，此時(shí)C12ThrNa的滴定含量約為 98%（見(jiàn)表1）。

考慮到C12ThrNa的親水基體積較大，而海明1622分子結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)乙氧基(EO)基團(tuán)，有可能導(dǎo)致海明1622與C12ThrNa形成的陰陽(yáng)離子締合物具有明顯的兩親性，進(jìn)而導(dǎo)致明顯的乳化現(xiàn)象。為排除海明1622分子結(jié)構(gòu)中EO基團(tuán)可能帶來(lái)影響，選擇用CTAB作為滴定劑再次進(jìn)行滴定分析。出乎意料的是，用CTAB滴定時(shí)體系中嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象依然存在(滴定數(shù)據(jù)見(jiàn)表1)，說(shuō)明該乳化現(xiàn)象并非完全由海明1622分子結(jié)構(gòu)上的EO基團(tuán)所致。

圖1 以海明1622滴定C12ThrNa

表1 C12ThrNa的兩相滴定數(shù)據(jù)結(jié)果

由此推測(cè)：C12ThrNa的親水頭基過(guò)大，與陽(yáng)離子表面活性劑的締合過(guò)程有較明顯的空間位阻效應(yīng)，使得C12ThrNa與滴定劑形成的陰陽(yáng)離子締合物具有明顯的兩親性，致使滴定過(guò)程中尤其是臨近滴定終點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生明顯的乳化現(xiàn)象，嚴(yán)重干擾了滴定終點(diǎn)的判斷。

值得指出的是，這種乳化現(xiàn)象可以通過(guò)局部滴加短鏈醇或添加中性強(qiáng)電解質(zhì)無(wú)機(jī)鹽等方法予以破乳，但是面臨著導(dǎo)致滴定分析結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 HPLC法

為簡(jiǎn)便處理，采用以C12Thr為分析樣進(jìn)行HPLC色譜條件建立和具體分析。采用甲醇為流動(dòng)相，Hedera ODS-2 C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱。流動(dòng)相流速為0.6 mL ·min-1時(shí)，LA和C12Thr可實(shí)現(xiàn)基線分離(見(jiàn)圖2)。 其中，LA的保留時(shí)間t約為9.66 min，C12Thr的保留時(shí)間t約為7.53 min；在LA-C12Thr混合樣中，LA和C12Thr的保留時(shí)間t與單獨(dú)樣相比沒(méi)有明顯的偏移，兩者之間實(shí)現(xiàn)很好的基線分離。與前文所述兩相滴定法相比，HPLC法可以在15 min內(nèi)很好地分離LA和C12Thr，極大地減少了檢測(cè)時(shí)間；不僅如此，兩相分析法所得結(jié)果為總陰離子表面活性劑含量，而HPLC法可以更加精準(zhǔn)地得到可能存在的原料酸和目標(biāo)氨基酸表面活性劑的具體含量。

圖2 LA與C12Thr的HPLC流出曲線圖

以質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo)，流出曲線峰面積A為縱坐標(biāo)繪制工作曲線(圖3)，進(jìn)行線性回歸分析。如圖3a所示，LA的濃度在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1范圍內(nèi)時(shí)，峰面積A與濃度c之間存在良好的線性關(guān)系，其線性方程為：A＝2.14×105c＋4.43×102，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9993；如圖3b所示，C12Thr的線性范圍濃度為：6.07×10-2～1.62 g·L-1，線性方程為：A＝2.41×105c＋1.98×103，R2為0.9985。

圖3 LA (a) 和 C12Thr (b) 的工作曲線

根據(jù)S/N(信噪比)＝3時(shí)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)樣濃度[20]，得出LA和C12Thr的檢測(cè)限分別為4.12×10-3g·L-1和4.32×10-3g·L-1，說(shuō)明該方法具有較好的靈敏度。

用上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)實(shí)際合成所得C12Thr的含量分析結(jié)果見(jiàn)表2。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)樣，C12Thr的面積歸一化含量為(99.27±0.08)%。采用外標(biāo)法[18-19,22]檢測(cè)到樣品中LA含量為(1.02±0.11)%，進(jìn)而得出C12Thr含量為(98.98±0.11)%，所得結(jié)果與兩相滴定法(見(jiàn)表1) 比較接近。

表2 C12Thr的含量 %

表3 LA和C12Thr的精密度測(cè)試

表4 LA和C12ThrNa的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

LA和C12Thr的精密度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3，LA和C12Thr樣品的RSD均小于2%，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好。

LA和C12Thr的空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，LA的空白加標(biāo)回收率為(99.47±0.16)%，RSD為0.14%；而C12Thr的空白加標(biāo)回收率為(99.55±0.18)%，RSD為0.16%?？梢?jiàn)，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。

3 結(jié)論

綜上所述，建立了一種可快速同時(shí)檢測(cè)C12Thr及其原料酸LA含量的HPLC分析方法。研究發(fā)現(xiàn)C12Thr線性范圍為6.07×10-2～1.62 g·L-1，檢測(cè)限為4.12×10-3g·L-1，空白加標(biāo)回收率為99.55±0.18%；LA的線性范圍在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1之間，檢測(cè)限為4.32×10-3g·L-1，空白加標(biāo)回收率為(99.47±0.16)%。與傳統(tǒng)的兩相滴定法相比，HPLC法所用試劑種類少、無(wú)需使用有毒溶劑、靈敏度較高，并極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在15 min內(nèi)完成。該分析流程的建立方法可為相關(guān)氨基酸表面活性劑生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和生產(chǎn)工藝監(jiān)控提供借鑒。