劉夢晴，吳陽洋，韓俊輝，俞益桂，陳寒青，吳文寧，李維組，尹艷艷

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室， 安徽 合肥 230022；2.合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院， 安徽 合肥 230009)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球第二大衰老性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡。研究表明：雌激素受體(estrogen receptors，ERs)中多存在于中腦多巴胺系統(tǒng)區(qū)域的是ERβ亞型，具有保持膠質(zhì)細胞數(shù)目，修復受損神經(jīng)細胞的功能[1-2]?；罨男∧z質(zhì)細胞會導致神經(jīng)炎癥并參與PD的發(fā)生發(fā)展[3]，當小膠質(zhì)細胞活化后，引發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)增多，將導致神經(jīng)元的變性死亡[4]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路參與炎性因子釋放，導致一氧化氮合成酶增多并誘導NO生成，與神經(jīng)退行性疾病有密切的關(guān)系[5]。雞豆黃素A(biochanin A，Bioch A)主要見于豆科植物，如鷹嘴豆和紅三葉草，屬于異黃酮類植物雌激素[6]，具有抗炎，神經(jīng)保護，抗細胞凋亡等多種功能[7-8]。本課題組前期探索了Bioch A與PD之間的關(guān)系，結(jié)果表明，Bioch A能夠抑制氧化應激以及炎癥因子釋放，同時，Bioch A還可以保護AngⅡ誘導的小鼠黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的損傷，然而，關(guān)于Bioch A保護DA能神經(jīng)元的機制仍需進一步的探討。本文建立LPS刺激小膠質(zhì)細胞活化的體外模型，研究雞豆黃素A是否通過雌激素受體抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化及其機制。

1 材料

1.1 細胞株BV2小膠質(zhì)細胞(來自中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學)。

1.2 藥品與試劑二甲基亞砜(D2650)、脂多糖(LPS)(L4391)、雌二醇(PHR2227)、Bioch A(5.32606)、雌激素受體抑制劑、ERK抑制劑(PD098059)、p38抑制劑(SB203580)、JNK抑制劑(SP600125)購自美國Sigma公司；NO和ROS檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；小鼠TNF-α、IL-1β(12426s)和PGE2的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自美國瑞沃德公司；兔抗p-p38、iNOS、p38抗體購自美國賽信通；兔抗IgG以及鼠抗β-actin抗體(AF50001)購自中杉金橋；兔抗p-NF-κB以及NF-κB購自美國Immuno Way公司。

1.3 主要儀器恒溫烘箱-DHG-9070型(上海三發(fā)科學儀器有限公司)；HB-R/O05型純水機(惠邦凈水設備有限公司)；全波長酶標儀-SpectraMax190型(美國Molecular Device公司)；恒溫培養(yǎng)箱-HealForce100型(力康生物醫(yī)療科技有限公司)；電子天平(上海天平儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾集團公司)；制冰機-AF100型(斯科茨曼制冰系統(tǒng)有限公司)。

1.4 小膠質(zhì)細胞株培養(yǎng)將BV2細胞置于DMEM培養(yǎng)基中(混合液含1%的青-鏈霉素以及10%的FBS溶液)，將培養(yǎng)基放置于恒溫的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2-3 d更換1次培養(yǎng)液，通過顯微鏡進行觀察，當培養(yǎng)瓶90%以上的面積被細胞占據(jù)或瓶底被鋪滿時，開始細胞傳代。要盡快完成細胞的復蘇過程，防止細胞死亡，影響最終的實驗結(jié)果。

1.5 實驗分組及處理本實驗將小膠質(zhì)細胞分為(1)Control組；(2)LPS(10 mg·L-1)組；(3)Bioch A(5 μmol·L-1)+LPS組；(4)Bioch A(5 μmol·L-1)+ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS組；(5)ER(0.1 μmol·L-1)+LPS組；(6)ER(0.1 μmol·L-1)+ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS組；(7)ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS組；(8)Rosup(0.1 μmol·L-1)+LPS組；(9)PD (0.02 μmol·L-1) +LPS組；(10)SP(0.01 μmol·L-1)+LPS組；(11)SB(0.02 μmol·L-1)+LPS組。加入上述藥物進行2 h預處理，除Control組外，其余組加入LPS(10 mg·L-1)進行36 h孵育。

1.6 NO的測定間接測定NO含量，通過Griess法檢測紅色重氮化合物，取對數(shù)生長期的BV2細胞，按照方法1.5將細胞分為1-7組，于恒溫箱中孵育24 h后收集每組上清。使用Griess試劑盒，按照規(guī)定的要求進行吸光度值測定，計算得到各組NO含量。

1.7 ROS檢測DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)ROS的含量。實驗按照實驗分組將BV2細胞分為1-8組，加藥處理2 h后，除Control組，剩余的組別加入LPS(10 mg·L-1)進行36 h培養(yǎng)。圖像采集后，通過Image-Pro Plus 6.0軟件來分析，計算出不同分組的平均熒光強度。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測定培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β和PGE2水平使用ELISA試劑盒測量。按照方法1.5將細胞分為1-7組，根據(jù) ELISA試劑盒說明書，完成細胞上清液的收集，孵育，洗板，避光顯色等操作，通過ELISA試劑盒檢測PGE2、IL-1β以及TNF-α的含量。

1.9 蛋白免疫印記法在培養(yǎng)好的BV2細胞中加入RIPA緩沖液以溶解,蛋白質(zhì)濃度通過雙辛酸(BCA)測定法測定。蛋白質(zhì)提取物經(jīng)PAGE分離后轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，放在5%脫脂牛奶在慢速搖床上封閉并在4 ℃條件下，用一抗繼續(xù)培養(yǎng)細胞膜過夜，當膜封閉好后，使用TBST洗滌3次，在室溫下將膜與HRP結(jié)合的二抗孵育2 h，隨后用TBST洗膜3次，配置ECL滴在膜上并在顯影儀中曝光，圖像保存，通過ImageJ軟件分析灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計通過SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，組間比較通過單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Bioch A對LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化后TNF-α、IL-1β、PGE2的影響結(jié)果如Fig 1所示。與Control組相比，LPS組TNF-α、IL-1β和PGE2含量明顯上升(P<0.01)；與LPS組相比，Bioch A以及ER組下調(diào)了炎癥因子含量(P<0.05)，ICI組無明顯變化(P>0.05)；與Bioch A組相比，Bioch A+ICI組炎癥因子表達上調(diào)(P<0.05)；與ER組比較，ER+ICI組同樣上升了炎癥因子水平(P<0.05)。結(jié)果表明，Bioch A通過雌激素受體，可以抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、PGE2表達。

Fig 1 Effects of Bioch A on levels of TNF-α, IL-1β, PGE2 in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.2 Bioch A對LPS誘導小膠質(zhì)細胞活化后iNOS和NO的影響結(jié)果如Fig 2所示，與Control組相比，LPS組NO含量(P<0.01)和iNOS表達(P<0.01)顯著增加；與LPS組比較，Bioch A以及ER組NO含量和iNOS的表達降低(P<0.05，P<0.01)，ICI組無明顯變化(P>0.05)；與Bioch A組相比，Bioch A+ICI組上調(diào)NO和iNOS水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明，Bioch A通過雌激素受體，可以抑制NO和iNOS表達。

Fig 2 Effects of Bioch A on NO, iNOS production in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.3 Bioch A對LPS誘導小膠質(zhì)細胞活化后p47phox、gp91phox、ROS的影響結(jié)果如Fig 3所示，與Control組比較，LPS組p47phox、gp91phox和ROS水平增加(P<0.01)；與LPS組比較，Bioch A以及ER組p47phox、gp91phox、ROS水平降低(P<0.01)；而ICI組無明顯變化(P>0.05)；與Bioch A組比，Bioch A+ICI組p47phox、ROS和 gp91phox的水平增加(P<0.05)。結(jié)果表明，Bioch A通過雌激素受體，可以抑制P47phox、ROS和gp91phox表達。

Fig 3 Effects of Bioch A on levels of gp91phox, p47phox, ROS in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.4 Bioch A對LPS誘導小膠質(zhì)細胞活化后p-p38、p-ERK和p-JNK的影響結(jié)果如Fig 4所示，與Control組相比，LPS組升高了p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白水平(P<0.01)；與LPS組比較，Bioch A以及ER組p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白水平下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，加入PD、SP和SB通路特異性抑制劑后，出現(xiàn)了明顯的抑制(P<0.01)，ICI組無明顯變化(P>0.05)；與Bioch A組比較，Bioch A+ICI組p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表達增多(P<0.05)；與ER組比較，ER+ICI組p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表達也增多(P<0.05，P<0.01)；上述結(jié)果表明，通過雌激素受體，Bioch A可以抑制p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表達。

Fig 4 Effects of Bioch A on levels of p-ERK, p-p38, p-JNK in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.5 Bioch A對LPS誘導小膠質(zhì)細胞活化后p-NF-κB和NF-κB的影響結(jié)果如Fig 5所示，各組間NF-κB蛋白的表達水平均沒有不同(P>0.05)。LPS組相較Control組，p-NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；相比LPS組，ER組以及Bioch A 組降低了p-NF-κB蛋白表達(P<0.05)，ICI組無明顯變化(P>0.05)；與ER組比較，ER+ICI組上調(diào)了p-NF-κB蛋白水平(P<0.05)；與Bioch A組相比，Bioch A+ICI組p-NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；結(jié)果表明，通過雌激素受體，Bioch A可以抑制p-NF-κB蛋白表達。

Fig 5 Effects of Bioch A on levels of NF-κB, p-NF-κB in LPS-induced BV2 cells n=3)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質(zhì)細胞會誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的發(fā)生，炎癥反應也會導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞活化。許多炎癥介質(zhì)和促炎因子由激活的小膠質(zhì)細胞生成和分泌，包括細胞因子、蛋白酶、活性氧等，其介導的神經(jīng)炎癥是PD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[9-10]。絲裂原活化蛋白激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，當受到細胞外刺激時，能夠通過處理和調(diào)節(jié)細胞特性，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞存活、分化、增殖和凋亡等重要作用[11]。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，是一種強效致炎因子，導致細胞或動物模型中帕金森相關(guān)的病理學變化，引起中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性、損傷[12-13]。本實驗選用LPS造模，觀察Bioch A能否通過雌激素受體抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化。

小膠質(zhì)細胞受到LPS刺激，激活NADPH氧化酶引起活性氧過度釋放，而ROS可參與人體細胞分化等生理活動，進而釋放TNF-α、IL-1β和PGE2等促炎細胞因子從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[14]。過量的炎癥因子釋放，導致誘導型一氧化氮合酶的增多以及NO的增加，NO介導炎性反應加重細胞損傷，在正常水平下，NO可引起血管擴張，促進血液循環(huán)，但其水平過高會加重對神經(jīng)細胞的毒害作用。若一直釋放有毒物質(zhì)或炎性因子，最終將導致DA能神經(jīng)元損傷。

雌激素在多種器官的靶點，如心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮保護作用。雌激素受體是雌激素作用的關(guān)鍵配體，主要包括兩種亞型ERα以及ERβ，在中腦DA區(qū)域中高表達的ERβ可發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用，與以神經(jīng)元損傷為主要特點的衰老性神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[15]。人參皂苷Rg1通過ERβ及MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路促進非淀粉樣蛋白切割，發(fā)揮神經(jīng)保護作用?；诖耍覀儽敬螌嶒炓矊ioch A保護DA能神經(jīng)元的機制進行進一步探討。本實驗中，通過LPS誘導小膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生ROS，增加TNF-α、IL-1β和PGE2蛋白的表達，進而激活MAPK引起神經(jīng)炎癥反應、細胞衰老分化等病理生理過程。而Bioch A預處理能夠有效的抑制炎癥因子的釋放、小膠質(zhì)活化以及MAPK信號通路激活。在加入雌激素受體抑制劑后，Bioch A的作用受到明顯的抑制，提示Bioch A通過雌激素受體抑制小膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

綜上所述，Bioch A通過雌激素受體抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化，與此同時也可能直接抑制氧化應激和炎癥，其機制可能與抑制MAPK信號通路有關(guān)。