顧 超，譚曉丹，向 葡，羅 映，楊俊卿，王 紅

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016；3.重慶市墊江縣人民醫(yī)院藥劑科，重慶 408300)

腦卒中是世界上致死率、致殘率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。其中缺血性卒中占腦卒中的60%-80%，目前臨床上針對(duì)缺血性腦卒中主要治療方式是通過物理或藥物溶栓，恢復(fù)缺血區(qū)血流供應(yīng)，但血流復(fù)灌又會(huì)引起腦缺血/再灌注損傷[2]。腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載等多種因素相關(guān)，且尚不完全明確。越來越多研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，且在腦缺血/再灌注不同時(shí)期，發(fā)揮著截然不同的作用[3-5]。因此，深入探究腦缺血/再灌注中自噬的調(diào)控機(jī)制，尋找缺血性腦卒中的干預(yù)新靶點(diǎn)，為腦缺血/再灌注損傷的預(yù)防和治療提供新的方向顯得十分必要。

鋅指/環(huán)指蛋白2(zinc and ring finger 2，ZNRF2)是一類特殊的膜相關(guān)E3泛素連接酶，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，在維持突觸建立發(fā)揮著重要的作用[6]；ZNRF2還參與氨基酸調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。最新研究表明，ZNRF2在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡進(jìn)程上發(fā)揮著重要作用，然而目前尚未見ZNRF2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用相關(guān)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模擬腦缺血/再灌注損傷體外模型，初步探討ZNRF2對(duì)腦缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞)，購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基(D649)購(gòu)于Sigma公司；DMEM無糖培養(yǎng)基(2177535)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于以色列Biological Industries公司；馬血清(abs989)購(gòu)于上海愛必信生物科技有限公司；胰蛋白酶(BL512A)、雙抗(BL505A)、PBS(BL302A)均購(gòu)于biosharp公司；ZNRF2過表達(dá)慢病毒(LVCON294)載體構(gòu)建委托上海吉?jiǎng)P基因公司完成；ZNRF2 siRNA干擾序列(R11077.2)由銳博公司合成；ZNRF2抗體(20200-1-AP)購(gòu)于武漢三鷹生物公司；mTOR(A5866)、LC3B(A52502)、β-actin(A5538)等抗體購(gòu)于bimake公司；p62(ab56416)、Beclin-1一抗均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；p-mTOR(ser2448)(D9C2)抗體購(gòu)于CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞超凈臺(tái)(SW-CJ-2FD)，高速低溫離心機(jī)(iCEN-24R)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(311)，三氣培養(yǎng)箱(3423)，多功能酶標(biāo)儀(721BR05752)均購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；電泳儀(041BR304570)，成像儀(VLBL00D2)購(gòu)于BIO-RAD。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 首先將PC12細(xì)胞分為正常組(normal)、模型組(OGD/R)，觀察ZNRF2在OGD/R模型中的改變；為了進(jìn)一步觀察ZNRF2對(duì)OGD/R致PC12細(xì)胞損傷的作用，我們采用ZNRF2過表達(dá)慢病毒上調(diào)ZNRF2表達(dá)以及ZNRF2小干擾RNA抑制ZNRF2表達(dá)，分別以ZNRF2空載病毒組、siRNA陰性對(duì)照作為空白對(duì)照組；將PC12細(xì)胞分為6組：正常組(normal)、氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧組(OGD/R)、ZNRF2空載病毒組(LV-NC)、ZRNF2過表達(dá)慢病毒組(LV-ZNRF2)、siRNA 陰性對(duì)照組(siNC)、ZNRF2小干擾RNA組(siR-ZNRF2)。

1.4.2OGD/R模型建立 除正常組外，其他組均需氧糖剝奪1 h，復(fù)糖復(fù)氧24 h建立OGD/R模型：將原有的DMEM高糖培養(yǎng)基棄去，加入DMEM無糖培養(yǎng)基，放入三氣培養(yǎng)箱(95% N2、5% O2，37 ℃)氧糖剝奪1 h后，將DMEM無糖培養(yǎng)基替換成DMEM高糖培養(yǎng)基，在5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代在DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%馬血清和5%胎牛血清，1%雙抗(抗青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)PC12細(xì)胞，PC12置于5% CO2、37 ℃溫度適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到85%左右進(jìn)行傳代。

1.4.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PC12按需求密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板后，分別加入ZNRF2過表達(dá)慢病毒(滴度：4×108kU·L-1)、空載病毒(病毒滴度：1×109kU·L-1)感染細(xì)胞6-8 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后觀察熒光。按riboFECTTMCP Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染ZNRF2 siRNA，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol·L-1，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，確定siRNA2為有效序列，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均用siRNA2序列進(jìn)行，ZNRF2 siRNA序列分別為:siRNA1:5′-CAGATGAAATGGATTTGCA-3′；siRNA2: 5′-AGAGCACCCTTCGGATTAA-3′; siRNA3: 5′-GCAATATGCCTTGAAGAAT-3′; siNC: 5′-GGCUCUAGAAAAGCCUAUGC-3′; 3′-TCCGAGAUCUUUUCGGAUACG-5′。

1.4.5MTT實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞以8 000個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，建立OGD/R 模型后，避光加入配置好的MTT溶液(0.5 g·L-1)20 μL/孔于37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，避光加入DMSO 150 μL/孔，水平搖床上震蕩15 min后，用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 接種于6孔板中的PC12細(xì)胞給藥造模后，收集上清于15 mL離心管中，用不含EDTA的0.25%胰酶將細(xì)胞細(xì)化為單個(gè)細(xì)胞，然后用PBS緩沖液1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，反復(fù)兩次。最后將細(xì)胞重懸于PBS(pH 7.2)500 μL緩沖液中，裝于1.5 mL的EP管中，及時(shí)送于重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.4.7qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中ZNRF2 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，OGD/R后，棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS緩沖液輕輕清洗后，加入1 mL TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟得到cDNA，以大鼠源β-actin作為內(nèi)參，采用qRT-RCR檢測(cè)ZNRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。大鼠源ZNRF2引物序列：前引物：3′-TAAGTGCCCGGTATGCTCAA-5′；后引物：5′-ATATACACAGGCAAGGCAGT-3′。

1.4.8Western blot檢測(cè)細(xì)胞各類蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞給藥造模后，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次，加入RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶2裂解液，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞裂解液置于冰上裂解30 min，低溫高速離心12 000 r·min-1，15 min，取上清用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜后，將含有蛋白的PVDF膜于5% BSA封閉液中室溫封閉2 h，加入ZNRF2 (1 ∶800)、LC3B (1 ∶1 000)、p62 (1 ∶2 000)、Beclin-1 (1 ∶1 000)、mTOR (1 ∶1 000)、p-mTOR (1 ∶1 000)、β-actin (1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液清洗3次(每次5 min)，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1 ∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜后，ECL發(fā)光液作用后，置于成像儀中成像，Image Lab軟件分析，β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ZNRF2在OGD/R處理PC12細(xì)胞損傷模型中明顯下調(diào)為了探究ZNRF2在OGD/R致PC12細(xì)胞損傷中的變化，采用qRT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)ZNRF2 mRNA、蛋白的表達(dá)變化。與Normal組相比，氧糖剝奪1 h，復(fù)糖復(fù)氧24 h后，ZNRF2 mRNA和蛋白均明顯下調(diào)，見Fig 1。

Fig 1 Expression of ZNRF2 down-regulated significantly in OGD/R-induced PC12

2.2 ZNRF2保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷為了進(jìn)一步觀察ZNRF2對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響，采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果如Fig 2所示，與Normal組相比，PC12細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧處理后，PC12細(xì)胞活力明顯減低、凋亡率明顯增加，LV-NC組、siNC組與OGD/R組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與LV-NC組相比，給予ZNRF2過表達(dá)慢病毒組后，PC12細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡明顯改善，而與siNC組相比，siR-ZNRF2組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，細(xì)胞凋亡率增加，加重了細(xì)胞損傷。結(jié)果表明，ZNRF2保護(hù) OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。

Fig 2 Effect of ZNRF2 on cell viability and apoptosis of OGD/R-induced PC12

2.3 ZNRF2對(duì)OGD/R處理的PC12細(xì)胞自噬水平的影響為了初步探討ZNRF2保護(hù)OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制，通過Western blot實(shí)驗(yàn)觀察PC12細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II、Beclin-1以及p62的表達(dá)改變。結(jié)果如Fig 3所示，氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)糖后，與Normal組相比，PC12 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白p62蛋白表達(dá)減少、Beclin-1蛋白和LC3II蛋白明顯增多，自噬被激活；與LV-NC組相比，LV-ZNRF2組中p62蛋白明顯上調(diào)，Beclin-1蛋白和LC3II蛋白表達(dá)降低，說明上調(diào)ZNRF2后，自噬被抑制；而相比于siNC組，下調(diào)ZNRF2后，p62蛋白表達(dá)降低，Beclin-1蛋白和LC3II蛋白表達(dá)增加，自噬加劇，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 3 ZNRF2 inhibited OGD/R-induced excessive activation of autophagy in PC12

2.4 過表達(dá)ZNRF2上調(diào)mTOR、p-mTOR(ser2448)蛋白表達(dá)為了初步探究ZNRF2調(diào)控自噬的機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)mTOR、p-mTOR(ser2448)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果如Fig 4所示，與Normal組相比，模型組中，mTOR、p-mTOR(ser2448)蛋白表達(dá)降低，給予ZNRF2過表達(dá)慢病毒后，mTOR、p-mTOR(ser2448)蛋白均明顯上調(diào)。

Fig 4 The protein expressions of mTOR and p-mTOR (ser2448) upregulated after transfecting ZNRF2 overexpression lentivirus

3 討論

自噬是真核細(xì)胞中通過溶酶體降解胞質(zhì)中受損細(xì)胞器或錯(cuò)誤蛋白的細(xì)胞自我保護(hù)途徑，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[8]。自噬不僅在許多生理過程如細(xì)胞增殖、分化與衰老中扮演著重要角色，亦在病理?xiàng)l件下也發(fā)揮著重要的作用，其中包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥、腦血管疾病等。研究表明，腦缺血/再灌注損傷中自噬被激活，在不同階段發(fā)揮著不同的作用，在再灌注前期，自噬通過清除細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊蛋白產(chǎn)生保護(hù)作用；再灌注后期自噬持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡或造成細(xì)胞二次傷害[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以通過上調(diào)自噬減輕氧糖剝奪誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生保護(hù)作用[10]；而TP53介導(dǎo)糖酵解和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子上調(diào)明顯改善OGD/R導(dǎo)致的原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的損傷，且自噬激活劑雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)其保護(hù)作用[11]；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可減少OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[12]。本次研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理的PC12細(xì)胞中自噬激活，PC12細(xì)胞活性降低、細(xì)胞凋亡增加，結(jié)果提示OGD/R誘導(dǎo)的自噬過度激活導(dǎo)致PC12細(xì)胞損傷。自噬是一把“雙刃劍”，參與腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展，探究自噬在腦缺血/再灌注損傷中的具體作用，明確自噬調(diào)控機(jī)制十分重要。

ZNRF2是一類膜相關(guān)的E3泛素酶，在中樞和外周神經(jīng)元高度表達(dá)，在維持細(xì)胞氨基酸穩(wěn)定、突觸可塑性方面發(fā)揮著重要作用。有研究證實(shí)，ZNRF2抑制人骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]；在非小細(xì)胞肺癌中，上調(diào)ZNRF2可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡[14]。最新研究表明LncRNA TTN-AS1/miR-153-3p/ZNRF2軸可以通過激活PI3K/AKT/mTOR調(diào)控癌細(xì)胞的增殖與凋亡參與乳頭狀甲狀腺癌病理進(jìn)程[15]，但在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ZNRF2表達(dá)可以明顯增加PC12細(xì)胞活力，減少PC12細(xì)胞凋亡率，從而保護(hù)OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷，而抑制PC12細(xì)胞中ZNRF2表達(dá)顯著加劇了OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)ZNRF2表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中LC3II/LC3I、Beclin-1蛋白表達(dá)增加伴隨p62蛋白表達(dá)降低的現(xiàn)象，抑制PC12細(xì)胞中自噬的過度激活，而下調(diào)ZNRF2表達(dá)后，OGD/R誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中自噬激活進(jìn)一步加劇，PC12細(xì)胞損傷加重。結(jié)果提示，ZNRF2減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，可能與抑制PC12細(xì)胞中的自噬激活相關(guān)。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要角色，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，ZNRF2通過上調(diào)mTOR，激活下游分子促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞的凋亡[14]；且有研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，ZNRF2與mTOR可能有直接的結(jié)合位點(diǎn)[17]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ZNRF2后，抑制自噬過度激活，而mTOR、p-mTOR(ser2448)相應(yīng)上調(diào)。因此，我們推測(cè)，ZNRF2抑制OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬激活，可能與上調(diào)mTOR相關(guān)，但該機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探究。

綜上所述，ZNRF2對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)mTOR,抑制OGD/R誘導(dǎo)的自噬激活途徑相關(guān)。ZNRF2有望成為干預(yù)腦缺血/再灌注損傷的新靶點(diǎn)。