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        陳皮HPLC指紋圖譜色譜條件優(yōu)化

        2021-06-15 01:44:08尚爾雨呂邵娃
        黑龍江科學(xué) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:陳皮指紋波長(zhǎng)

        李 影,尚爾雨,孫 爽,呂邵娃

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150040; 2.黑龍江省森林保護(hù)研究所,哈爾濱 150040)

        高效液相色譜法將組分分離與定量分析或定性鑒定相結(jié)合,為中藥研究提供了一種分析復(fù)雜樣品的有效方法,已成為21世紀(jì)最重要的色譜技術(shù)之一,并得到國(guó)際認(rèn)可[1-5]。 將HPLC應(yīng)用于中藥研究,可鑒定中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)并了解其作用機(jī)理。建立中藥指紋圖譜時(shí),要求所得圖譜一定要符合系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性等特征,其前期色譜條件的選擇會(huì)直接影響指紋圖譜質(zhì)量,因此建立指紋圖譜前,需要花費(fèi)大量時(shí)間對(duì)色譜條件進(jìn)行考察[6-9]。陳皮(CitriReticulataePericarpium)為臨床常用中藥,是蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮,道地藥材為廣東新會(huì)的茶枝柑果皮[10]。優(yōu)化陳皮藥材的HPLC色譜條件,以期為后期指紋圖譜建立提供基礎(chǔ),為陳皮的鑒定和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司生產(chǎn)),BJH-W300K電陶瓷鍋(廣東天際電器股份有限公司生產(chǎn)),AB265-S托利多十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)),SB-5200D SCIENTZ超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)),BUCHI R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI有限公司生產(chǎn))。

        1.2 試藥

        陳皮購(gòu)于哈爾濱市同仁堂大藥房,以上藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)訓(xùn)教研室呂邵娃教授鑒定為正品,標(biāo)本存放于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。對(duì)照品川陳皮素(批號(hào)17050510)、蕓香柚皮苷(批號(hào)18030408)、橙皮苷(批號(hào)171203)、橙皮素(批號(hào)171121)、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮(批號(hào)171108)、維采寧-2(批號(hào)170610)、甜橙黃酮(批號(hào)180117)、異甜橙黃酮(批號(hào)180366)、橘皮素(批號(hào)170510)、5-去甲川陳皮素(批號(hào)170816)。以上對(duì)照品均購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。甲醇,乙腈,色譜純(美國(guó) Mreda 公司生產(chǎn)),甲酸,色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

        2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

        2.1 供試品溶液制備

        將陳皮洗凈并晾干,取陳皮100 g加入10倍水浸泡1.5 h,煮沸60 min,過(guò)濾得其濾液,再次加入適量水煮沸30 min,過(guò)濾并將兩次濾液合并,濃縮至200 mL,保存?zhèn)溆?。? mL(0.5 g生藥/mL) 繼續(xù)濃縮至浸膏,將浸膏用甲醇溶解,并用100 mL容量瓶定容, 離心,過(guò)一次性微孔濾膜得到0.02 g生藥/mL,保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 萃取條件的選擇

        分別將陳皮水煎液用正丁醇、乙酸乙酯+正丁醇進(jìn)行萃取,各萃取三次,旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑后,用水溶解并定容至50 mL,過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣分析,并與其進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)圖1。

        圖1 樣品前處理工藝考察Fig.1 Investigation of sample pretreatment process

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正丁醇及乙酸乙酯萃取40 min后,所要的目標(biāo)峰沒(méi)有出現(xiàn),峰個(gè)數(shù)較少,不符合要求,故選擇陳皮水煎液進(jìn)樣分析。

        2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        對(duì)同一份陳皮水煎液考察波長(zhǎng)為283 nm、300 nm、330 nm下的色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖2。

        圖2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇Fig.2 Selection of detection wavelength

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,波長(zhǎng)為300 nm下色譜峰峰形較好,分離效果佳,基線平穩(wěn),滿足要求,故波長(zhǎng)300 nm為進(jìn)樣分析的最佳波長(zhǎng)。

        2.4 洗脫程序的選擇

        以乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)作為流動(dòng)相,以條件1為初始洗脫比例,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行比例調(diào)整,所得色譜圖見(jiàn)圖3。

        圖3 洗脫條件的選擇Fig.3 Selection of elution conditions

        條件1:0~20 min 90%(A)、20~35 min 90%~75%(A)、35~50 min 75%~30%(A)、50~60 min 30%~90%(A)。

        條件2:0~20 min 90%(A)、20~45 min 90%~75%(A)、45~65 min 75%~40%(A)、65~75min 40%~90%(A)。

        條件3:0~20 min 90%(A)、20~50 min 90%~77% (A)、50~52 min 77%(A)、52~95 min 77%~40%(A)、95~100 min 40%~90% (A)。

        條件4:0~20 min 90%(A)、20~50 min 90%~76%(A)、50~51 min 76% (A)、51~90 min 76%~42%(A)、90~95 min 42%~90%(A)。

        條件5:0~20 min 90%(A)、20~49 min 90%~75%(A)、49~55 min 75%~70%(A)、55~90 min 70%~42%(A)、90~95 min 42%~90%(A)。

        條件6:0~10 min 90%(A)、10~50 min 90%~78%(A)、50~60 min 78%~72%(A)、60~95 min 72%~42%(A)、95~100 min 42%~90%(A)。

        以上色譜圖相比較,條件6的目標(biāo)峰更加清晰,峰型好,分離效果佳,無(wú)拖尾現(xiàn)象,基線平穩(wěn),故選該條件為最佳洗脫條件。

        2.5 柱溫和流速的選擇

        按已經(jīng)確定的色譜柱及流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)柱溫(30℃、35℃和40℃)和流速(0.7、1.0和1.3 mL/min)進(jìn)行考察,結(jié)果顯示,0.7 mL/min流速下色譜峰出峰較慢,分析時(shí)間較長(zhǎng),1.3 mL/min 流速下部分色譜峰分離效果較差。比較不同柱溫下圖譜發(fā)現(xiàn),30℃時(shí),色譜峰分離度較好,柱溫升高到35℃與40℃時(shí),色譜峰分離度不佳,最終確定柱溫為30℃,流速為1.0 mL/min。

        2.6 色譜條件的確定

        綜上所述,最佳色譜條件為:色譜柱采用Venusil XBP C18(L)(5μm,4.6×250 mm);流動(dòng)相:乙腈(B)-0.1%甲酸水(A);洗脫條件:0~10 min 90%(A)、10~50 min 90%~78%(A)、50~60 min 78%~72%(A)、60~95 min 72%~42%(A)、95~100 min 42%~90%(A);檢測(cè)波長(zhǎng):300 nm;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min。所得結(jié)果見(jiàn)圖4。

        2.7 方法學(xué)考察結(jié)果

        2.7.1 精密度試驗(yàn)

        取同一批陳皮,按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液20 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄HPLC圖譜。結(jié)果可知,在6次進(jìn)樣中,相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%,相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

        注:1:維采寧-2;2:蕓香柚皮苷;3:橙皮苷;4:橙皮素;5:甜橙黃酮;6:異甜橙黃酮;7:川陳皮素;8:3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮;9:橘皮素;10:5-去甲川陳皮素圖4 陳皮水煎液100min色譜圖Fig.4 100min chromatogram of water decoction of Citri Reticulatae Pericarpium

        2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取

        取同一批陳皮,按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣,測(cè)定其HPLC指紋圖譜。提取6張圖譜的共有模式譜圖,計(jì)算各圖譜與共有模式圖譜之間的相似度。結(jié)果顯示,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.0%,相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)非常穩(wěn)定。

        2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

        取同一批陳皮,按“2.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,分別測(cè)定其HPLC指紋圖譜。提取6張圖譜的共有模式譜圖,計(jì)算各圖譜與共有模式圖譜之間的相似度。結(jié)果顯示,各相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%,相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

        3 討論

        陳皮所含成分相對(duì)復(fù)雜,而對(duì)陳皮的鑒別與含量測(cè)定不僅可以檢測(cè)橙皮苷,還可以利用中藥指紋圖譜對(duì)陳皮進(jìn)行更加全面的檢驗(yàn),這樣更能有效地控制陳皮質(zhì)量[11]。但關(guān)于陳皮指紋圖譜的文獻(xiàn)和研究較少,檢驗(yàn)方法也不夠精煉和完善,需要展開(kāi)更深層次的研究,故篩選試樣處理方法,優(yōu)化色譜分析條件為陳皮HPLC指紋圖譜的建立奠定基礎(chǔ)。陳皮的主要化學(xué)成分包括黃酮、生物堿、揮發(fā)油等,選擇良好的色譜條件是建立指紋圖譜的關(guān)鍵。考察不同萃取條件和多種洗脫程序的梯度洗脫能力,優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫和流速等分析條件,建立的HPLC方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性,符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

        綜上所述,最佳色譜條件為:色譜柱:采用Venusil XBP C18(L)(5 μm,4.6×250 mm);流動(dòng)相:乙腈(B)-0.1%甲酸水(A);洗脫條件:0~10 min 90%(A)、10~50 min 90%~78%(A)、50~60 min 78%~72%(A)、60~95 min 72%~42%(A)、95~100 min 42%~90%(A);檢測(cè)波長(zhǎng):300 nm;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min。篩選出了最優(yōu)的色譜條件,為有效控制陳皮內(nèi)在質(zhì)量及后續(xù)研究提供科學(xué)參考依據(jù)。

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