李 影，尚爾雨，孫 爽，呂邵娃

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱 150040)

高效液相色譜法將組分分離與定量分析或定性鑒定相結(jié)合，為中藥研究提供了一種分析復(fù)雜樣品的有效方法，已成為21世紀(jì)最重要的色譜技術(shù)之一，并得到國(guó)際認(rèn)可[1-5]。 將HPLC應(yīng)用于中藥研究，可鑒定中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)并了解其作用機(jī)理。建立中藥指紋圖譜時(shí)，要求所得圖譜一定要符合系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性等特征，其前期色譜條件的選擇會(huì)直接影響指紋圖譜質(zhì)量，因此建立指紋圖譜前，需要花費(fèi)大量時(shí)間對(duì)色譜條件進(jìn)行考察[6-9]。陳皮(CitriReticulataePericarpium)為臨床常用中藥，是蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，道地藥材為廣東新會(huì)的茶枝柑果皮[10]。優(yōu)化陳皮藥材的HPLC色譜條件，以期為后期指紋圖譜建立提供基礎(chǔ)，為陳皮的鑒定和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司生產(chǎn))，BJH-W300K電陶瓷鍋(廣東天際電器股份有限公司生產(chǎn))，AB265-S托利多十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司生產(chǎn))，SB-5200D SCIENTZ超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn))，BUCHI R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI有限公司生產(chǎn))。

1.2 試藥

陳皮購(gòu)于哈爾濱市同仁堂大藥房，以上藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)訓(xùn)教研室呂邵娃教授鑒定為正品，標(biāo)本存放于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。對(duì)照品川陳皮素(批號(hào)17050510)、蕓香柚皮苷(批號(hào)18030408)、橙皮苷(批號(hào)171203)、橙皮素(批號(hào)171121)、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮(批號(hào)171108)、維采寧-2(批號(hào)170610)、甜橙黃酮(批號(hào)180117)、異甜橙黃酮(批號(hào)180366)、橘皮素(批號(hào)170510)、5-去甲川陳皮素(批號(hào)170816)。以上對(duì)照品均購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。甲醇，乙腈，色譜純(美國(guó) Mreda 公司生產(chǎn))，甲酸，色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

將陳皮洗凈并晾干，取陳皮100 g加入10倍水浸泡1.5 h，煮沸60 min，過(guò)濾得其濾液，再次加入適量水煮沸30 min，過(guò)濾并將兩次濾液合并，濃縮至200 mL，保存?zhèn)溆?。? mL(0.5 g生藥/mL) 繼續(xù)濃縮至浸膏，將浸膏用甲醇溶解，并用100 mL容量瓶定容, 離心，過(guò)一次性微孔濾膜得到0.02 g生藥/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 萃取條件的選擇

分別將陳皮水煎液用正丁醇、乙酸乙酯+正丁醇進(jìn)行萃取，各萃取三次，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑后，用水溶解并定容至50 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣分析，并與其進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣品前處理工藝考察Fig.1 Investigation of sample pretreatment process

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇及乙酸乙酯萃取40 min后，所要的目標(biāo)峰沒(méi)有出現(xiàn)，峰個(gè)數(shù)較少，不符合要求，故選擇陳皮水煎液進(jìn)樣分析。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)同一份陳皮水煎液考察波長(zhǎng)為283 nm、300 nm、330 nm下的色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇Fig.2 Selection of detection wavelength

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，波長(zhǎng)為300 nm下色譜峰峰形較好，分離效果佳，基線平穩(wěn)，滿足要求，故波長(zhǎng)300 nm為進(jìn)樣分析的最佳波長(zhǎng)。

2.4 洗脫程序的選擇

以乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)作為流動(dòng)相，以條件1為初始洗脫比例，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行比例調(diào)整，所得色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫條件的選擇Fig.3 Selection of elution conditions

條件1：0～20 min 90%(A)、20～35 min 90%～75%(A)、35～50 min 75%～30%(A)、50～60 min 30%～90%(A)。

條件2：0～20 min 90%(A)、20～45 min 90%～75%(A)、45～65 min 75%～40%(A)、65～75min 40%～90%(A)。

條件3：0～20 min 90%(A)、20～50 min 90%～77% (A)、50～52 min 77%(A)、52～95 min 77%～40%(A)、95～100 min 40%～90% (A)。

條件4：0～20 min 90%(A)、20～50 min 90%～76%(A)、50～51 min 76% (A)、51～90 min 76%～42%(A)、90～95 min 42%～90%(A)。

條件5：0～20 min 90%(A)、20～49 min 90%～75%(A)、49～55 min 75%～70%(A)、55～90 min 70%～42%(A)、90～95 min 42%～90%(A)。

條件6：0～10 min 90%(A)、10～50 min 90%～78%(A)、50～60 min 78%～72%(A)、60～95 min 72%～42%(A)、95～100 min 42%～90%(A)。

以上色譜圖相比較，條件6的目標(biāo)峰更加清晰，峰型好，分離效果佳，無(wú)拖尾現(xiàn)象，基線平穩(wěn)，故選該條件為最佳洗脫條件。

2.5 柱溫和流速的選擇

按已經(jīng)確定的色譜柱及流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)柱溫(30℃、35℃和40℃)和流速(0.7、1.0和1.3 mL/min)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，0.7 mL/min流速下色譜峰出峰較慢，分析時(shí)間較長(zhǎng)，1.3 mL/min 流速下部分色譜峰分離效果較差。比較不同柱溫下圖譜發(fā)現(xiàn)，30℃時(shí)，色譜峰分離度較好，柱溫升高到35℃與40℃時(shí)，色譜峰分離度不佳，最終確定柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min。

2.6 色譜條件的確定

綜上所述，最佳色譜條件為：色譜柱采用Venusil XBP C18(L)(5μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)；洗脫條件：0～10 min 90%(A)、10～50 min 90%～78%(A)、50～60 min 78%～72%(A)、60～95 min 72%～42%(A)、95～100 min 42%～90%(A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。所得結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.7 方法學(xué)考察結(jié)果

2.7.1 精密度試驗(yàn)

取同一批陳皮，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖譜。結(jié)果可知，在6次進(jìn)樣中，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

注：1：維采寧-2；2：蕓香柚皮苷；3：橙皮苷；4：橙皮素；5：甜橙黃酮；6：異甜橙黃酮；7：川陳皮素；8：3，5，6，7，8，3′,4′-七甲氧基黃酮；9：橘皮素；10：5-去甲川陳皮素圖4 陳皮水煎液100min色譜圖Fig.4 100min chromatogram of water decoction of Citri Reticulatae Pericarpium

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取

取同一批陳皮，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，測(cè)定其HPLC指紋圖譜。提取6張圖譜的共有模式譜圖，計(jì)算各圖譜與共有模式圖譜之間的相似度。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)非常穩(wěn)定。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批陳皮，按“2.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定其HPLC指紋圖譜。提取6張圖譜的共有模式譜圖，計(jì)算各圖譜與共有模式圖譜之間的相似度。結(jié)果顯示，各相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 討論

陳皮所含成分相對(duì)復(fù)雜，而對(duì)陳皮的鑒別與含量測(cè)定不僅可以檢測(cè)橙皮苷，還可以利用中藥指紋圖譜對(duì)陳皮進(jìn)行更加全面的檢驗(yàn)，這樣更能有效地控制陳皮質(zhì)量[11]。但關(guān)于陳皮指紋圖譜的文獻(xiàn)和研究較少，檢驗(yàn)方法也不夠精煉和完善，需要展開(kāi)更深層次的研究，故篩選試樣處理方法，優(yōu)化色譜分析條件為陳皮HPLC指紋圖譜的建立奠定基礎(chǔ)。陳皮的主要化學(xué)成分包括黃酮、生物堿、揮發(fā)油等，選擇良好的色譜條件是建立指紋圖譜的關(guān)鍵。考察不同萃取條件和多種洗脫程序的梯度洗脫能力，優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫和流速等分析條件，建立的HPLC方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

綜上所述，最佳色譜條件為：色譜柱：采用Venusil XBP C18(L)(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)；洗脫條件：0～10 min 90%(A)、10～50 min 90%～78%(A)、50～60 min 78%～72%(A)、60～95 min 72%～42%(A)、95～100 min 42%～90%(A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。篩選出了最優(yōu)的色譜條件，為有效控制陳皮內(nèi)在質(zhì)量及后續(xù)研究提供科學(xué)參考依據(jù)。