馮立國 陳湘蓮 徐 寧 黃曉輝*

（1 湖南省食用菌研究所，湖南長沙 410013；2 湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南懷化 418000）

繡球菌〔Sparassis crispa（Wulfen）Fr.〕隸屬于真菌界擔(dān)子菌門異隔擔(dān)子菌綱非褶孔菌目繡球菌科（李傳華 等，2013），是一種食藥兼具的菌類，在日本非常受歡迎（Kimura，2013）。繡球菌的葡聚糖含量超過40%，研究表明，每日按照1 000 mg ·kg-1體重口服繡球菌多糖可以有效改善糖尿病小鼠的傷口愈合不良情況（Kwon et al.，2009）；口服繡球菌多糖能增強環(huán)磷酰胺（CY）誘導(dǎo)的白細(xì)胞減少癥小鼠的造血反應(yīng)（Ohno et al.，2002）；繡球菌多糖對前列腺癌細(xì)胞系具有抗癌活性（Bekci et al.，2019）；對小鼠進(jìn)行繡球菌多糖喂養(yǎng)，可顯著降低小鼠小腸和血漿中的TNF-a 水平（Uchida et al.，2019）?？梢姡C球菌多糖極具醫(yī)療和保健功效，并且多糖制備過程相對環(huán)保，對繡球菌中特有的活性多糖進(jìn)行研究非常具有價值和意義。

近幾年，采用超聲輔助提取多糖的研究較多，多糖得率顯著提高。陳程等（2018）利用超聲輔助酶法提取牡丹籽餅中的多糖，在最佳工藝條件下，牡丹籽餅中多糖提取量為196.87 mg · g-1。陳金娥等（2018）采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取三七根多糖，多糖得率達(dá)到19.51%。Zhang 等（2020）通過響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助酶提取技術(shù)提取繡球菌多糖，產(chǎn)率高達(dá)14.63%，與傳統(tǒng)的熱水提取（HWE）方法相比提高了68.54%。繡球菌的多糖主要集中在細(xì)胞壁，湖南省食用菌研究所保鮮加工課題組利用超聲輔助纖維素酶進(jìn)行繡球菌多糖的提取，通過超聲的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能有效破裂植物細(xì)胞壁，同時輔助纖維素酶的降解作用，加速多糖的析出，并利用響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，確定了繡球菌多糖提取的參數(shù)，進(jìn)一步提高了繡球菌多糖的得率。

1 材料與方法

1.1 材料

參試?yán)C球菌在市場中采購，將新鮮繡球菌置于烘箱中70 ℃烘干至恒重，粉碎至200 目備用。

主要儀器包括T6 新世紀(jì)分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SCIENTZ-ⅡD 超聲波粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），最大功率950 W；數(shù)字式研磨儀〔維根技術(shù)（北京）有限公司〕；長城DL-400 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

主要試劑包括濃硫酸、苯酚（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司），無水乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司），檸檬酸（天津大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取方法 準(zhǔn)確稱取繡球菌干粉5 g，加入配制好的纖維素酶液，再加入超純水進(jìn)行料液比配置，按照設(shè)定值進(jìn)行超聲提取，完成后迅速放入100 ℃的水浴中滅活10 min；然后10 000 r ·min-1離心10 min，取上清液作為待測液。

1.2.2 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸比色法測定提取液中的多糖含量（徐光域 等，2005），經(jīng)預(yù)試驗確定待測液稀釋20 倍作為待測樣品，吸取1.0 mL 待測樣品按下式計算多糖得率。

可溶性多糖得率=（C×V×N）/（X×M× 103）× 100%

式中，C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得多糖的質(zhì)量濃度（mg · mL-1）；V為提取液的體積；N為提取液稀釋倍數(shù)（20 倍）；M為繡球菌粉質(zhì)量（5 g）；X為測定樣品的體積（1 mL）；

1.2.3 單因素試驗 共考慮5 個因素對多糖提取率的影響，各因素濃度梯度見表1，進(jìn)行單個因素試驗時，其他因素取其梯度方案中的中位數(shù)。每個梯度3 次重復(fù)，采用DPS 7.05 軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD 法）。

表1 單因素試驗設(shè)計方案

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，確定纖維素酶添加量為3%，超聲功率570 W，利用Design-Expert 11.04 軟件，采用Box-Behnken 設(shè)計方案，以料液比A（50 g · mL-1）、提取溫度B（50℃）和超聲時間C（70 min）為0 點值進(jìn)行編碼，共設(shè)計17 個試驗點，其中5 個中心復(fù)合點，12 個析因點。通過軟件擬合得到二次方程及預(yù)測最佳條件。

1.2.5 最佳提取條件 稱取5 g 繡球菌干粉，按照預(yù)測最佳條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗，取均值驗證。稱取50 g 繡球菌干粉，按照預(yù)測最佳條件進(jìn)行多糖提取，對離心后的溶出液進(jìn)行含量測定；收集濾渣，再次按照最佳提取條件進(jìn)行多糖提取，離心收集溶出液并再次進(jìn)行含量測定；收集2 次的溶出液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 mL，加入400 mL 無水乙醇至80%濃度，置于4 ℃冰箱冷藏過夜，離心得到沉淀即為繡球菌粗多糖。

1.2.6 分離與純化 精密稱取繡球菌粗多糖2 g，加雙蒸水40 mL 配成5%的粗多糖液，采用Sevage法去除蛋白。去除蛋白后的粗多糖液用30%的氨水調(diào)至pH 為8.0，逐滴添加20% H2O2至溶液為淺黃色，50 ℃水浴保溫2 h，繡球菌粗多糖基本呈透明色，10 000 r · min-1離心10 min 后裝入3 500 D（道爾頓）透析袋，每隔12 h 換水1 次，透析2 d。將透析袋中的液體取出，水浴濃縮至10 mL，加入4 倍體積無水乙醇沉淀過夜，10 000 r · min-1離心10 min 取沉淀，沉淀經(jīng)無水乙醇、無水乙醚多次洗滌后，得到純度較高的多糖，采用苯酚硫酸法測定多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖含量分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg · mL-1，吸光度值為0、0.23、0.48、0.75、0.95、1.28，經(jīng)函數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=12.614x-0.015 7，R2=0.996，線性關(guān)系良好，可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同料液比對繡球菌多糖得率的影響20～60 g · mL-1料液比梯度下繡球菌多糖提取率依次是14.29%、15.06%、16.51%、18.21%、19.84%。結(jié)果表明，料液比對繡球菌多糖得率有著較為顯著的影響，多糖得率隨料液增加不斷增加，未找到料液比與多糖得率的拐點。將料液比確定為響應(yīng)面試驗的交互因素之一。

2.2.2 不同提取溫度對繡球菌多糖得率的影響30～70 ℃提取溫度梯度下繡球菌多糖提取率依 次 是20.14%、20.75%、16.71%、13.54%、14.56%。隨著提取溫度升高，多糖得率總體表現(xiàn)降低趨勢，與蔣孟如等（2016）未添加相關(guān)酶的試驗結(jié)果剛好相反。原因可能是在酶加入的條件下，溫度升高，酶的活性喪失導(dǎo)致多糖得率降低，因此在添加相關(guān)酶的條件下，后期響應(yīng)面試驗設(shè)計中應(yīng)控制超聲功率和溫度。

2.2.3 不同超聲時間對繡球菌多糖得率的影響20～80 min 超聲時間梯度下繡球菌多糖提取率依次是13.29%、14.11%、14.58%、15.41%、18.70%、19.00%、19.88%。結(jié)果表明，隨著超聲時間的加長，多糖得率明顯增加，將超聲時間確定為響應(yīng)面交互因素之一。

2.2.4 不同超聲功率對繡球菌多糖得率的影響190～665 W 超聲功率梯度下繡球菌多糖提取率依次是11.70%、12.73%、14.55%、16.32%、19.86%、17.67%。隨著超聲功率的提高，多糖得率有較大的提升，在超聲功率570 W 時出現(xiàn)了拐點，因此，不將超聲功率作為交互因素。

2.2.5 纖維素酶添加量對多糖得率的影響 1%～5%纖維素酶濃度梯度下繡球菌多糖提取率依次是13.54%、16.20%、16.61%、16.67%、16.82%。在纖維素酶添加量為3%時，增加酶添加量對多糖得率影響不大，因此不將酶添加量作為交互因素。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

按照1.2.1 多糖提取步驟，酶添加量為3%，超聲功率570 W，按照軟件設(shè)計的3 因子3 水平共計17 個試驗點，試驗結(jié)果見表2。運用Design-Expert 11.04 軟件對表2 的試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到繡球菌多糖得率（Y）對料液比（A）、酶添加量（B）和超聲時間（C）的二次多項回歸方程為：Y=23.07+1.64A+0.569B -0.746 9C -0.055AB -0.035AC+0.098BC -0.03A2+0.287B2-1.32C2。回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計方案與試驗結(jié)果

從回歸模型方差分析結(jié)果可以看出（表3）：該模型P＜0.01，失擬項＞0.05，模型顯著，說明模型與數(shù)據(jù)之間擬合度好，可以用此模型及因素預(yù)測多糖的提取效率，并且模型試驗數(shù)據(jù)可靠。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

從模型中各因素的P值可以判斷，因素A、B、C、BC、B2、C2（P＜0.01）對模型影響極顯著；因素AB（P＜0.05）對模型影響顯著；因素AC（P≥0.05）交互影響不顯著。從各因素的F值判斷，各因素對多糖得率影響的強弱次序為：A（料液比）＞C（提取溫度）＞B（超聲時間）。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，說明試驗誤差小。因此可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。

2.4 3 個因素交互作用對多糖提取率的等高線和響應(yīng)面

料液比和超聲時間兩個因素交互作用下的P=0.035 6，兩者的交互作用對多糖得率影響顯著，從圖1 可以看出，隨料液比和超聲時間的增加，多糖得率不斷上升，同時料液比曲面斜率大于超聲時間曲面斜率，表明提取繡球菌多糖時，可以通過增加料液比、延長超聲時間或多次提取以增加多糖得率。

由圖2 可知，料液比與提取溫度兩個因素交互作用下的P=0.142，兩者交互作用對多糖得率影響不顯著。在單因素試驗中發(fā)現(xiàn)，在料液比低、超聲功率大的條件下，多糖提取液升溫很快；溫度過高，滅活了纖維素酶的活性，影響多糖得率，因而在響應(yīng)面試驗中設(shè)計了較低的溫度區(qū)間并提高料液比值，排除了部分料液比和溫度之間的交互影響。料液比曲面斜率大于提取溫度曲面的斜率，表明提取繡球菌多糖時，料液比對多糖得率的影響大于提取溫度對多糖得率的影響。料液比增加，多糖得率不斷提高，在溫度38 ℃附近多糖得率最高，為24.00%。

提取溫度和超聲時間兩個因素交互作用下的P=0.000 25，兩者的交互作用對多糖得率影響極顯著（圖3）。超聲時間增加，有利于多糖得率提高，但隨著超聲時間增加，多糖提取液的溫度升高，影響酶活，降低多糖得率，兩者交互作用明顯。

從等高線圖、響應(yīng)面圖及方差分析結(jié)果可以直觀看出，料液比、提取溫度和超聲時間3 個因素對繡球菌多糖得率均有極顯著影響。通過模型預(yù)測，提取最佳參數(shù)為：料液比1∶87.62（g · mL-1），提取溫度38.4 ℃，提取時間94.56 min，預(yù)測多糖得率為31.49%。對最佳預(yù)測模型參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，為便于操作，將試驗參數(shù)調(diào)整為料液比1∶90（g · mL-1），提取溫度38 ℃，超聲時間95 min，進(jìn)行多糖提取，平均多糖得率為30.60%，與模型評估值相比，相對誤差為2.9%。加大繡球菌粉質(zhì)量到50 g，按照最佳工藝進(jìn)行多糖提取，平均多糖得率為31.70%，合并第1 次提取的濾渣，提取條件與第1 次相同，第2 次多糖得率為7.1%。與模型評估值相比，相對誤差為0.6%。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的繡球菌超聲波輔助纖維素酶法提取多糖工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本試驗建立的模型在實踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。

2.5 純化后多糖的保留率

經(jīng)1.2.6 的方法純化后，多糖保留率為73.20%。

3 結(jié)論與討論

常用的多糖提取方法有水提法、醇提法、酶提法、超聲提法，以及多種方法的復(fù)合提法。湖南省食用菌研究所保鮮加工課題組采用單因素試驗方法，確定了影響多糖得率的3 個主要因素后，采用Box-behnken 設(shè)計優(yōu)化了3 個因素的最佳值。優(yōu)化后的最佳值為：酶添加量3%，超聲功率570 W，料液比1∶90（g · mL-1），提取溫度38 ℃，超聲時間95 min。在此條件下，稱取繡球菌粉5 g 進(jìn)行試驗驗證，多糖得率為30.60%；稱取50 g 繡球菌粉按照最佳優(yōu)化條件進(jìn)行2 次提取，第1 次多糖得率為31.70%，合并第1 次提取的濾渣，提取條件與第1 次相同，第2 次多糖得率為7.1%，說明一次提取繡球菌仍然有較多的多糖成分未析出，加大料液比及二次提取可以較大地提高多糖得率。將所得的粗多糖液合并濃縮，去除蛋白和色素并透析純化后，多糖保留率達(dá)到73.20%，說明經(jīng)此法提取多糖，粗多糖中的雜質(zhì)亦不多，此法可以作為繡球菌活性多糖提取的有效方法。