張 萌 翟乾行 朱承余 鄭麗寧 張 浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

化學(xué)殺菌劑在植物病害防治中起著重要的作用，但是長(zhǎng)期使用后抗藥性增強(qiáng)，防效降低、用量增大，同時(shí)污染生態(tài)環(huán)境（趙新貝 等，2016）。如何減少化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生副作用是目前亟待解決的問題。生物防治是最具潛力并可良好替代化學(xué)農(nóng)藥的安全防治技術(shù)（張慶萍 等，2019）。番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一種危害嚴(yán)重的世界性病害（李培謙 等，2018；潘曉梅 等，2019）。長(zhǎng)期以來，防治番茄灰霉病的方法主要是大量施用化學(xué)農(nóng)藥，但是灰霉病菌繁殖快、變異度大等特點(diǎn)使得病菌對(duì)化學(xué)藥劑極易產(chǎn)生抗藥性，另一方面人們對(duì)抗藥性及食品安全問題的認(rèn)識(shí)不斷提高，使得利用生物防控技術(shù)防治灰霉病菌的需求更加迫切（韓麗 等，2013）。生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，具有選擇性強(qiáng)、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、不破壞生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)（畢秋艷 等，2015），現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是能夠控制果蔬病害的一類重要生防菌，其分布廣泛，施用方便，能有效抑制多種病原微生物，防治柑橘青霉病和綠霉病具有很好效果，而且對(duì)煙草灰霉菌菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用（李悅 等，2014；王智榮，2019）。

為了提高拮抗菌的防治效果，減少化學(xué)藥劑的使用量，本試驗(yàn)從8 種化學(xué)殺菌劑中選擇啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配，旨在篩選出對(duì)番茄灰霉病菌控制效果比較好的藥劑及最適的配比，為番茄灰霉病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019 年5—10 月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地溫室大棚和資源與環(huán)境學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 熒光假單胞菌YG-1 菌株（P.fluorescens）和番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)研究室分離獲得。

1.1.2 化學(xué)殺菌劑 50%腐霉利WP（霍州市綠洲農(nóng)藥有限公司），50%異菌脲WP（山東澳得利化工有限公司），25%嘧菌酯SC（江蘇利民化工有限公司），25 g · L-1咯菌腈EC（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），250 g · L-1吡唑醚菌酯EC（杭州宇龍化工有限公司），50%氟啶胺SC（喬貝爾作物保護(hù)有限公司），50%啶酰菌胺WG（巴斯夫歐洲公司），80%嘧霉胺WDG（山東綠豐農(nóng)藥有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基及番茄品種 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1.0 L。

LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1.0 L。

番茄品種：大地紅寶石，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 不同殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法（趙冬梅 等，2017；馬超 等，2018）測(cè)定8 種殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用。取適量無菌水分別將8 種殺菌劑溶解于100 mL 容量瓶中定容，制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg · L-1的母液。將10 mL 用無菌水稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的母液與40 mL 滅菌PDA 培養(yǎng)基均勻混合，制成5 個(gè)不同梯度濃度的含藥培養(yǎng)基，其中咯菌腈、啶酰菌胺含藥培養(yǎng)基濃度為2、0.4、0.08、0.016、0.003 2 mg · L-1，吡唑醚菌酯、腐霉利、嘧霉胺、異菌脲含藥培養(yǎng)基濃度為10、5、2.5、1.25、0.625 mg ·L-1，氟啶胺、嘧菌酯含藥培養(yǎng)基濃度為50、10、2、0.4、0.08 mg · L-1，對(duì)照組為等量無菌水與PDA 培養(yǎng)基均勻混合。將番茄灰霉病菌直徑為5.0 mm 的菌餅接種到含藥培養(yǎng)基中心培養(yǎng)5～6 d，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。通過十字交叉法測(cè)定各處理菌落直徑，并計(jì)算抑制率（楊利敏，2015；范文忠 等，2019）。

抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑× 100%

1.2.2 熒光假單胞菌對(duì)番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 將熒光假單胞菌YG-1 在固體LB 培養(yǎng)基上活化，活化后接種到含有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到接種液，將所得接種液分別配制成濃度為1.0 × 105、1.0 × 106、1.0 × 107、1.0 × 108、1.0 × 109CFU · mL-1的發(fā)酵液。采用1.2.1 的方法測(cè)定不同濃度熒光假單胞菌YG-1 培養(yǎng)基上番茄灰霉病菌的菌落直徑，計(jì)算抑制率，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。

1.2.3 熒光假單胞菌YG-1 與殺菌劑的生物相容性

根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果將具有較強(qiáng)毒力的2 種殺菌劑配制成質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 mg ·L-1的LB 含藥培養(yǎng)基，然后用移液槍吸取10 μL 熒光假單胞菌YG-1。將發(fā)酵液覆蓋在含藥平板表面，空白對(duì)照組加入等量的無菌水，并置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。通過平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)情況，并記錄菌落數(shù)量。

1.2.4 復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測(cè)定 根據(jù)8種殺菌劑毒力測(cè)定結(jié)果及熒光假單胞菌與殺菌劑的生物相容性，選取啶酰菌胺與熒光假單胞菌YG-1進(jìn)行復(fù)配。以啶酰菌胺和熒光假單胞菌的到有效中質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)，分別將藥劑及發(fā)酵液配制到有效中質(zhì)量濃度0.081 mg · L-1與1.97 × 108CFU ·mL-1，再按V（啶酰菌胺）∶V（熒光假單胞菌）=10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10 進(jìn)行復(fù)配，并且根據(jù)復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病菌的實(shí)際抑制生長(zhǎng)率及預(yù)期抑制生長(zhǎng)率，計(jì)算毒性比率。毒性比率＞1 為增效作用，毒性比率＜1 為拮抗作用，毒性比率=1 為相加作用。

預(yù)期抑制生長(zhǎng)率（%）=單劑A 的EC50劑量實(shí)際抑制生長(zhǎng)率×配比中的百分率+單劑B 的EC50劑量實(shí)際抑制生長(zhǎng)率×配比中的百分率

毒性比率=實(shí)際抑制生長(zhǎng)率/預(yù)期抑制生長(zhǎng)率

1.2.5 復(fù)配劑協(xié)同防治番茄灰霉病菌的盆栽效果測(cè)定 為進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病菌的協(xié)同防治效果，2019 年5 月于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)處理：a，5 mL 50%啶酰菌胺WG 0.081 mg · L-1和5 mL YG-1 1.97 × 108CFU · mL-1的混合液；b，10 mL 50%啶酰菌胺WG 0.081 mg · L-1；c，10 mL YG-1 1.97 × 108CFU · mL-1發(fā)酵液；d，10 mL 清水作為對(duì)照。每個(gè)處理選取12 盆番茄植株，3 次重復(fù)。選取生長(zhǎng)一致的具有3 出復(fù)葉的番茄苗，將4 個(gè)處理分別噴灑在番茄葉片上，24 h 后，葉面噴霧接種孢子濃度為1 × 106CFU ·mL-1的番茄灰霉病菌孢子懸浮液。接種后5～7 d調(diào)查發(fā)病水平。番茄灰霉病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，葉片上無病斑；1 級(jí)，葉片上病斑1～3 個(gè)；3 級(jí)，葉片上病斑4～6 個(gè)；5 級(jí)，葉片上病斑7～10 個(gè)；7 級(jí)，葉片上病斑11～20 個(gè)，部分密集成片。9 級(jí)，葉片上病斑密集，占葉片總面積的1/4 以上（王新茹 等，2008；魏繼剛 等，2014；胡文淵，2017）。計(jì)算病情指數(shù)，采用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)分析防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的毒力分析

由表1 可以看出：8 種化學(xué)殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用，但不同殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)抑制作用不同，其毒力大小依次為咯菌腈、啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、腐霉利、嘧霉胺、異菌脲、氟啶胺、嘧菌酯。其中咯菌腈、啶酰菌胺對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較高，其EC50值分別為0.075、0.081 mg · L-1，而嘧菌酯的抑制活性最低，其EC50值為4.357 mg · L-1?？┚?、啶酰菌胺在較低濃度下均能有效抑制番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)，所以選擇咯菌腈和啶酰菌胺進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，測(cè)定2 種殺菌劑與熒光假單胞菌YG-1 的生物相容性。

表1 8 種殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測(cè)定

2.2 熒光假單胞菌YG-1 對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測(cè)定

YG-1 熒光假單胞菌菌懸液對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測(cè)定結(jié)果見表2。當(dāng)熒光假單胞菌濃度在1.0 ×105～1.0 × 109CFU · mL-1時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)均有抑制效果，其抑制率為16.28%～64.56%，抑制中濃度EC50值為1.97 × 108CFU · mL-1。

表2 熒光假單胞菌對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測(cè)定

2.3 熒光假單胞菌與化學(xué)殺菌劑的相容性分析

由表3 可以看出，啶酰菌胺與熒光假單胞菌YG-1 具有較好的生物相容性，當(dāng)啶酰菌胺濃度為50 mg · L-1時(shí)，熒光假單胞菌YG-1 能夠正常生長(zhǎng)，菌落數(shù)為3.43 × 1010CFU · mL-1，與對(duì)照差異不顯著；當(dāng)啶酰菌胺濃度為100 mg · L-1時(shí)，YG-1 的菌落數(shù)為2.91 × 1010CFU · mL-1，極顯著低于對(duì)照；當(dāng)啶酰菌胺濃度為150 mg · L-1時(shí)，YG-1 的菌落數(shù)相比對(duì)照也極顯著減少，但仍能達(dá)到2.56 × 1010CFU · mL-1。而當(dāng)咯菌腈的濃度為50～200 mg · L-1時(shí)，YG-1 的菌落數(shù)均極顯著低于對(duì)照。綜合考慮，由于啶酰菌胺對(duì)番茄灰霉病菌的毒力較強(qiáng)，抑制率較高，其EC50值為0.081 mg · L-1，并且與熒光假單胞菌菌株有較好的生物相容性，故選擇啶酰菌胺和生防菌株YG-1 進(jìn)行復(fù)配。

表3 啶酰菌胺和咯菌腈對(duì)熒光假單胞菌菌體生長(zhǎng)的影響

2.4 啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的聯(lián)合毒力

啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的聯(lián)合毒力測(cè)定結(jié)果見表4，可以看出啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配比例分別為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6 和3∶7（體積比）時(shí)，毒性比率分別為1.201 5、1.322 0、1.411 2、1.340 2 和1.284 0，均起到增效作用。其中當(dāng)啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配比為5∶5 時(shí)毒性比率最大，具有較好的增效作用。

表4 啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的影響

2.5 啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的盆栽防治效果

將0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU ·mL-1的熒光假單胞菌YG-1 菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配，進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。如表5 所示，啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配對(duì)番茄灰霉病的防效較好，且復(fù)配劑中殺菌劑施用量為單劑施用量的一半，其防效為71.31%，極顯著高于單劑啶酰菌胺和熒光假單胞菌YG-1 菌株發(fā)酵液的處理。盆栽試驗(yàn)結(jié)果與室內(nèi)聯(lián)合毒力測(cè)定結(jié)果基本一致，當(dāng)0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU · mL-1的熒光假單胞菌YG-1 菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率及對(duì)番茄植株灰霉病的防治效果均好于單獨(dú)使用啶酰菌胺或熒光假單胞菌。

表5 番茄灰霉病菌盆栽防治效果分析

3 討論與結(jié)論

番茄灰霉病是影響番茄產(chǎn)量的重要因素（張亞 等，2015），目前番茄灰霉病的防治主要以化學(xué)防治為主（王凌云 等，2012；Shen et al.，2016），但由于灰霉病菌生活周期短、產(chǎn)孢量大、病害傳播快，并且生產(chǎn)中長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)使用單一類型的殺菌藥劑，導(dǎo)致灰霉病菌對(duì)多菌靈、異菌脲、乙霉威、嘧菌胺和氟啶胺等常規(guī)殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性（黃海，2014）。通過生防菌株與化學(xué)藥劑的復(fù)配防治植物病害已有一些相關(guān)報(bào)道，研究表明生防細(xì)菌甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌NJ13 分別與嘧菌環(huán)胺和苯醚甲環(huán)唑復(fù)配對(duì)人參黑斑病菌的防治達(dá)到增效作用（陳長(zhǎng)卿 等，2019）；地衣芽孢桿菌W10 與咪鮮胺復(fù)配可以對(duì)桃枝枯病的防治起到增效作用（紀(jì)兆林 等，2019）。而關(guān)于利用生物—化學(xué)策略防治番茄灰霉病的報(bào)道卻很少。因此，探索有效利用生防菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治番茄灰霉病的新方法尤為重要。

本試驗(yàn)突破單獨(dú)利用化學(xué)藥劑防治病害的局限性，嘗試采用生防菌與低毒化學(xué)藥劑復(fù)配協(xié)同防治番茄灰霉病，室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果明確了0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU · mL-1的熒光假單胞菌菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制有明顯的增效作用，其盆栽試驗(yàn)防效為71.31%。盡管盆栽試驗(yàn)將啶酰菌胺的施用量減少了一半，但是啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配結(jié)果仍優(yōu)于單獨(dú)使用啶酰菌胺，進(jìn)一步說明生防菌與化學(xué)藥劑的聯(lián)合作用能夠有效地增強(qiáng)防治效果，相對(duì)于化學(xué)防治而言，減少了農(nóng)藥的用量及抗藥性的產(chǎn)生，并且使生防菌的防治能力提高、穩(wěn)定性增強(qiáng)，可以達(dá)到減量增效的目的，對(duì)番茄灰霉病的防治具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。從化學(xué)藥劑減量的角度，開展生防菌劑與化學(xué)殺菌劑協(xié)同應(yīng)用，一方面為番茄灰霉病化學(xué)藥劑減量防控提供了有效的替代方案，也為后續(xù)相關(guān)復(fù)配劑型的開發(fā)提供了依據(jù)，找到對(duì)環(huán)境更為友好的治理方案，通過高效低毒殺菌劑和生防菌的協(xié)同防治達(dá)到理想的防治效果。