孫健 張強等

摘 要： 【目的】研究有機蘋果園和常規(guī)蘋果園的土壤微生物結(jié)構(gòu)差異，為蘋果園土壤改良提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳员本┦胁絽^(qū)連續(xù)5 a應(yīng)用有機栽培方法的10個蘋果園和4個常規(guī)管理蘋果園的土壤為對象，利用磷脂脂肪酸多態(tài)性（PLFA）技術(shù)和稀釋平板計數(shù)法研究兩種管理方式下果園土壤微生物的結(jié)構(gòu)差異?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，有機園和常規(guī)園的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。常規(guī)果園土壤微生物總PLFA為114.99 nmol·g-1，是有機果園（43.44 nmol·g-1）的2.6倍，但有機果園PLFA豐富度高19%，生物多樣性高。有機蘋果園土壤微生物中革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比例為1.50，常規(guī)蘋果園為0.30；有機蘋果園真菌生物量占2.84%，常規(guī)果園為6.55%，差異顯著。二類果園可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異不顯著?！窘Y(jié)論】有機蘋果園和常規(guī)蘋果園的土壤微生物結(jié)構(gòu)存在顯著差異，常規(guī)蘋果園農(nóng)藥及化肥的使用降低了微生物群落的豐富度和功能多樣性。

關(guān)鍵詞： 有機蘋果園； 常規(guī)管理果園； 土壤微生物； 群落結(jié)構(gòu)； 磷脂脂肪酸分析

中圖分類號：S661.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980

中國是世界第一大蘋果生產(chǎn)國和消費國，2010年我國的蘋果栽培面積和產(chǎn)量分別占世界的51%和48%[1]；長期以來，蘋果生產(chǎn)始終遵守“上山下灘，不與糧棉爭田”的原則，土壤瘠薄、有機質(zhì)含量低、化肥用量大等導(dǎo)致的土壤酸化、養(yǎng)分不平衡、土壤質(zhì)量退化問題，直接影響到蘋果樹體生長、產(chǎn)量增加和品質(zhì)提高。果樹有機栽培在世界發(fā)達國家發(fā)展較快，而我國才剛剛起步，北京市近幾年來大力推廣以土壤改良、增肥地力為基礎(chǔ)的果樹有機栽培技術(shù)，土壤質(zhì)量和果實品質(zhì)有了較大的提高。土壤微生物是土壤重要有機組成部分，并參與土壤中養(yǎng)分的固定、分解、循環(huán)與轉(zhuǎn)化等過程[2]，并且可以與作物的根系發(fā)生互作[3]，直接影響土壤的有效肥力和作物生長。植物種類[4]和耕作方式會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生穩(wěn)定的影響，果樹栽培耕種周期長，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響顯著[5]。研究蘋果園有機和傳統(tǒng)土壤管理方式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異及對土壤微生物的影響，對蘋果園土壤改良、培肥地力和保持蘋果樹可持續(xù)生產(chǎn)具有重要的意義。從20世紀(jì)90年代中期開始，大量國內(nèi)外的研究表明土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)是反映土壤肥力和健康狀況的重要指標(biāo)[6-8]。Pennanen等[9]基于PLFA檢測提出了真菌比例降低、細菌比例上升通常與土壤肥力呈正相關(guān)。Mazzola等[10]發(fā)現(xiàn)小麥等禾本科植物的生長提高了惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的生物量，降低了熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的生物量，從而抑制土壤中植物病原真菌含量、預(yù)防和減輕蘋果重茬病。果樹生長周期長，受土壤微生物的影響更為顯著[11- 12]。近年來部分國內(nèi)學(xué)者開展了相關(guān)工作，李會科等[13]報道了田間生草可以提高果園土壤中三大類菌（細菌、放線菌、真菌）的類群數(shù)量，顯著提高土壤過氧化氫酶、尿酶、堿性磷酸酶活性，改良土壤品質(zhì)；李丙智等[14]對短枝富士蘋果園土壤進行沼液配施鉀肥處理，土壤容重比和孔隙度等物理性狀得到改善，三大類菌數(shù)量提高，果實品質(zhì)有所提高；李智衛(wèi)等[15]研究了不同樹齡的蘋果園土壤微生物特征，提出老齡果園真菌比例提高，微生物多樣性降低的問題；張強等[16]對北京周邊不同產(chǎn)量蘋果園、梨園、桃園、葡萄園的土壤微生物群落研究，發(fā)現(xiàn)不同果園土壤微生物總量和構(gòu)成差異顯著。本研究通過連續(xù)5 a應(yīng)用有機栽培方法進行增施有機的土壤改良和培肥力后的10個蘋果園和4個常規(guī)管理蘋果園的土壤調(diào)查，應(yīng)用PLFA技術(shù)和稀釋平板法分析二類蘋果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確反映微生物群落的整體狀況，探討有機和常規(guī)蘋果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異特點，為蘋果園土壤改良、培肥地力提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2009年10月，于北京市昌平區(qū)（東經(jīng)116°，北緯40°），選擇土壤質(zhì)地均為壤土，樹齡15～20 a生，株行距為3 m×5 m，主栽品種為宮藤富士（Malus domestica Borkh ‘Red Fuji），砧木為八楞海棠（M. micromalus Makino），王林為授粉品種，產(chǎn)量基本穩(wěn)定在30 000～45 000 kg·hm-2，連續(xù)5 a應(yīng)用有機栽培方法的蘋果園10個、常規(guī)管理的蘋果園4個，每個果園面積0.6 hm2以上；有機果園的土壤管理是不施用任何化學(xué)肥料，每年秋季或春季增施30 000～45 000 kg·hm-2腐熟有機肥，常規(guī)管理果園每年秋季或春季增施15 000～30 000 kg· hm-2農(nóng)家肥，并按照常規(guī)方法施用化學(xué)肥料。蘋果果園主要營養(yǎng)狀況見表1。

1.2 樣品采集及分析

在每個果園隨機選取3個取樣區(qū)，每個取樣區(qū)在樹冠垂直投影以內(nèi)30 cm處，以土鉆采集0～40 cm層次的土壤，混勻后分別進行土壤理化性質(zhì)測定、PLFA檢測、微生物稀釋平板涂布計數(shù)法檢測。

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定 烘干法測定土壤含水量，高溫外加熱重鉻酸鉀氧化容量法測定土壤有機質(zhì)，凱氏定氮法測定土壤全氮，H2SO4-H2O2消解-釩鉬黃比色法測定土壤全磷，堿解擴散法測定堿解氮，碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷，乙酸銨浸提-火焰光度計法測定速效鉀，醋酸鈉浸提-原子吸收法分析有效鈣，DTPA浸提-原子吸收分光光度法分析有效鐵，氫氟酸-高氯酸-硝酸消煮-原子吸收光譜法測定全鉻，pH計測定土壤pH。

1.2.2 土壤磷脂脂肪酸測定 PLFA的提取、分離和甲脂化參考Frostegard等[17]的方法。PLFA分析用GC-MS聯(lián)用儀分析（Agilent HP6890，安捷倫公司，美國），毛細管為HP-5ms （規(guī)格60 m × 0.32 mm，惠普公司，美國），以磷脂脂肪酸19∶0作為內(nèi)參。以高純氦氣作載氣，不分流進樣。進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度270 ℃。初始溫度80 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速率升到160 ℃，以5 ℃·min-1的速率達到溫度270 ℃。

1.2.3 土壤微生物的稀釋平板計數(shù)法 稱取干重為10 g的新鮮土壤樣品，以無菌水配成菌懸液，十倍稀釋法進行稀釋并涂板培養(yǎng)。細菌、放線菌、真菌分別選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌、重鉻酸鉀改良高氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌和鏈霉素-馬丁氏孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，分別對土壤細菌、放線菌和真菌進行菌落計數(shù)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19，CANOCO 4.5，Microsoft Excel 2007分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

統(tǒng)計了10個有機蘋果園和4個常規(guī)管理果園的土壤理化性質(zhì)，以SPSS軟件進行T檢驗比較，統(tǒng)計結(jié)果見表1。有機蘋果園和常規(guī)蘋果園在有機質(zhì)、全氮、全氮、全磷、堿解氮、有效磷、有效鉀、有效鈣和有效鐵含量以及酸堿度差異不顯著。

2.2 土壤微生物群落差異分析

2.2.1 PLFA差異的主成分分析 對有機蘋果園和常規(guī)管理蘋果園的土壤微生物磷脂脂肪酸結(jié)構(gòu)進行主成分分析可以發(fā)現(xiàn)土壤微生物分為2個類群，有機果園和常規(guī)果園差別顯著，2種生產(chǎn)管理方式下土壤微生物群落的差異顯著且高于同種生產(chǎn)方式的內(nèi)部差異。

2.2.2 PLFA生物指示因子統(tǒng)計 如表2所示，施用化肥的常規(guī)果園與有機果園的各項生物指示因子差異顯著（P﹤0.01）。相比于有機果園，施用化肥可以大幅提高土壤微生物PLFA的總量，但同時微生物的多樣性下降19%，種群多樣性遭到破壞。常規(guī)管理果園中革蘭氏陰性菌為主體，而有機果園中革蘭氏陽性菌為細菌主要類群，有機果園土壤微生物中革蘭氏陽性菌和陰性菌的比例為1.5∶1，是常規(guī)果園的5倍。常規(guī)果園土壤中真菌比重是有機果園的2.1倍。

2.3 可培養(yǎng)土壤微生物計數(shù)

有機蘋果園土壤可培養(yǎng)細菌、放線菌、真菌數(shù)量均值低于常規(guī)蘋果園，但是以SPSS進行T檢驗結(jié)果為2者差異不顯著。

3 討 論

隨著公眾對食品衛(wèi)生安全的關(guān)注度不斷提高，蘋果有機化生產(chǎn)得到迅速發(fā)展[18]，有機栽培比例逐漸提高，但目前對有機果園土壤狀況的研究尚少。蘋果樹生長周期長，傳統(tǒng)果園在30 a以上，新型果園也在15 a以上，不同生產(chǎn)方式對果園土壤的影響具有累積效應(yīng)，而土壤的健康狀況直接決定了蘋果的可持續(xù)生產(chǎn)。本試驗研究了有機蘋果園和常規(guī)果園的土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)差異。二類果園在有機質(zhì)、全氮、全磷、堿解氮、有效磷、有效鉀、有效鈣、有效鐵等養(yǎng)分水平和土壤酸堿度等方面差異不顯著，但土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差別。PLFA主成分分析表明，二類果園的土壤微生物形成了不同的類群。常規(guī)果園土壤微生物總PLFA達到114.99 nmol·g-1，是有機果園的2.6倍，但是PLFA豐富度降低19%，微生物群落多樣性明顯下降。常規(guī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式中農(nóng)藥化肥的使用會降低土壤微生物群落的多樣性，Zhang等[19]對稻田的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究同樣發(fā)現(xiàn)施用化肥可以將微生物總PLFA量由25 nmol·g-1提高到59 nmol·g-1，同時使土壤微生物PLFA豐富度由20.0降低到14.0；Ge等[20]研究茶園土壤微生物結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)施用尿素會使土壤微生物的種類多樣性大幅降低?；屎娃r(nóng)藥的使用不但提高生產(chǎn)成本、導(dǎo)致土壤板結(jié)、引起水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題，還會對土壤微生物類群多樣性和群落構(gòu)成造成不利影響，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

傳統(tǒng)的果園土壤質(zhì)量評價主要針對有機質(zhì)、酸堿度、孔隙度等物理/化學(xué)指標(biāo)，而作為土壤長期肥力的一個重要指示因子，土壤微生物群落的健康程度決定了果園的抗病害能力[21]和可持續(xù)發(fā)展能力[22]，但是缺乏對其評價的量化指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示常規(guī)管理的蘋果園土壤真菌比例、真菌與細菌PLFA的比值均高于有機蘋果園土壤。而H？觟gberg等[23]研究發(fā)現(xiàn)真菌與細菌PLFA比值與土壤氮礦化能力呈負相關(guān)，說明有機蘋果園土壤的微生物群落氮固定能力較高。革蘭氏陽性菌與植物組織、有機質(zhì)的降解能力有關(guān)[24]，是土壤健康狀況的重要指示因子，而農(nóng)藥和殺蟲劑的使用以及重金屬污染都會降低革蘭氏陽性菌的生物量并提高革蘭氏陰性菌的生物量[25]。有機蘋果園中革蘭氏陽性菌為細菌主要類群，Gram+/Gram-值約為1.5且所有被測有機蘋果園的比值均高于1.2；而常規(guī)蘋果園中革蘭氏陰性菌為主體，Gram+/Gram-值約為0.3，說明化肥和農(nóng)藥的使用對果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響顯著。在一定耕作條件下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有相對的穩(wěn)定性，因此Gram+/Gram-比值可以作為果園土壤質(zhì)量評價指標(biāo)。本實驗中統(tǒng)計兩種類型果園土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量差異不明顯。

土壤微生物群落作為一個微觀生態(tài)系統(tǒng)，具有一定的穩(wěn)定性[26]。農(nóng)藥和化肥的使用作為外界干預(yù)會打破其自身的穩(wěn)定性，造成少數(shù)適宜種群大量繁殖，部分不適宜種群受到抑制。常規(guī)果園土壤微生物的總PLFA量高于有機果園，但是微生物種群多樣性下降反映了這種影響。同時，微生物也反作用于環(huán)境因素，部分微生物對土壤物理形態(tài)的維持具有重要作用，該類群功能被抑制很可能和化肥使用后的土壤板結(jié)相關(guān)。有機果園具有更高的微生物種群多樣性，從生態(tài)學(xué)的角度來講，因為其物種豐富，對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，穩(wěn)定性較強，更具有可持續(xù)發(fā)展的潛力。同時正是自然環(huán)境土壤的生態(tài)復(fù)雜性導(dǎo)致可培養(yǎng)微生物只占小部分，同時平板計數(shù)法無法分辨類群內(nèi)部的種群分布，因此在兩類果園土壤中差異并不顯著。

4 結(jié) 論

有機蘋果園土壤微生物群落比常規(guī)管理果園組成復(fù)雜，更符合可持續(xù)發(fā)展的要求。土壤微生物的Gram+/Gram-比值和真菌PLFA百分?jǐn)?shù)可以作為果園土壤質(zhì)量監(jiān)控的重要參數(shù)。微生物中具體種屬的分布與土壤生產(chǎn)能力的關(guān)系需要深入研究。

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