易子欣，易 婷，姚心雨，祝貝貝，賁亞琍，張 雯

（江漢大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，湖北武漢 430000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌不足（1 型糖尿?。┗蛞葝u素抵抗（2 型糖尿?。┮鸬囊唤M代謝性疾病。糖尿病患者的高血糖環(huán)境，誘發(fā)結構蛋白和基質分子氧化產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），導致毛細血管病變[1-3]，引發(fā)多種并發(fā)癥。牙周病是涉及牙周支持組織的炎性和破壞性疾病，臨床特征包括牙齦炎癥、牙周附著喪失、牙周袋形成和牙槽骨吸收。研究表明糖尿病與慢性牙周炎之間有著雙向的密切關系[4]。糖尿病可以引發(fā)牙周組織氧化應激，進而導致牙周組織的進一步損傷以及牙槽骨的吸收[5-7]。微計算機斷層掃描技術（micro computed tomography，Mi?cro-CT）可準確有效觀察骨組織細微結構，其分辨率達到微米級別，能對小型樣本重建并呈現(xiàn)3D 影像，對標本進行定性及定量分析[8]。本實驗擬以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1 型糖尿病大鼠模型，探討Micro-CT掃描技術用于觀測糖尿病大鼠牙槽骨微結構的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗選用健康雄性Sprague-Dawley 大鼠（5～ 6周齡，體重約200～225 g）8只，贛南醫(yī)科大學動物中心購入并通過動物倫理審核。STZ 購自德國Boeh?ringer Mannheim 公司；乙二胺四乙酸二鈉（10%EDTA），蘇木素染料，伊紅染料（購自美國Sigma 公司）；血糖試紙（購自Miles Australia Pty.Ltd）；4%多聚甲醛（購自中國上海生物工程有限公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD 大鼠隨機分為對照組和STZ（糖尿?。┙M（n=4），自由飲水和攝食，常規(guī)飼養(yǎng)一周后進行實驗。STZ組大鼠腹腔內注射55 mg/kg STZ[9]，對照組大鼠給予同等體積的0.1 M檸檬酸鹽緩沖液。72 h后大鼠空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L 的大鼠被視為糖尿病造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)12 周，并于第6 周和12 周檢測大鼠空腹血糖水平。

1.3 HE染色

處死大鼠，取上頜骨，經(jīng)生理鹽水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。保持組織細胞基本固有物質，并使組織硬化。右側上頜骨于10%EDTA溶液脫鈣8 周。經(jīng)脫水、包埋制備石蠟切片。選擇包括完整的冠、根和牙周組織進行切片（5 μm，中軸方向）。切片放入蘇木素染液中浸染5 min，流水沖洗返藍，再沖洗，后用酒精脫水，伊紅染液浸染5 min。400倍光學顯微鏡下拍攝大鼠上頜磨牙間牙齦乳頭部位照片，CaseViewer 2.0進行分析，評估釉牙骨質界（ce?mento-enamel junction，CEJ）牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的距離。

1.4 Micro-CT掃描成像分析

使用Micro-CT（SkyScan1176，Bruker，Kontich，比利時）掃描大鼠右側上頜骨樣本。掃描完成后，軟件CT analyser 手動選擇興趣區(qū)間（Region of interest，ROI）：右側上頜第一磨牙根分叉區(qū)域。軟件Datev?iewer 對ROI 進行三維重建，觀察牙槽骨吸收情況。軟件CT analyser對ROI區(qū)域的骨小梁結構進行參數(shù)測量，測量三次取平均值。主要測量參數(shù)包括骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁間距（trabec?ular separation，Tb.sp）。CT analyser 像素（pixel size）18 μm，最低灰度閾值（lower grey threshold）95，最高灰度閾值（upper grey threshold）255。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。兩個獨立樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病模型大鼠的血糖值變化

STZ組大鼠腹腔注射STZ后，第6周和12周分別檢測血糖，STZ 組大鼠的空腹血糖水平均≥ 16.7 mmol/L，72 h后空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L，提示造模成功，見表1。正常對照組大鼠空腹血糖水平保持在5.0 mmol/L左右。

表1 STZ誘導糖尿病大鼠模型的不同時間血糖值變化（mmol/L）

2.2 HE染色切片分析大鼠牙槽骨吸收程度

HE染色觀察大鼠上頜磨牙間牙槽嵴頂部位，可見正常對照大鼠牙槽骨邊緣光滑，牙周膜纖維排列整齊，見圖1A。STZ 組大鼠牙槽骨邊緣可見明顯吸收，牙周膜纖維排列紊亂，牙齦上皮有明顯的炎癥細胞浸潤，見圖1B。CaseViewer 2.0 軟件測量CEJ-ABC距離，結果顯示STZ 組相較正常對照組CEJ-ABC 距離明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.492，P <0.05），見圖1C。

圖1 大鼠上頜骨磨牙HE染色（×40）

2.3 Micro-CT分析牙槽骨微結構

Micro-CT 掃描大鼠右側上頜骨樣本進行重構后，比較兩組牙槽骨吸收程度。可見較正常對照組，見圖2A，STZ組大鼠上頜骨磨牙矢狀正中面，有明顯牙槽骨吸收見圖2B。與對照組比較，STZ組骨小梁數(shù)目（Tb.N）明顯降低（t=4.610，P<0.05），見圖2C，骨小梁間距（Tb.sp）明顯升高（t=2.678，P<0.05），見圖2D。

圖2 大鼠右側上頜第一磨牙Micro-CT 分析

3 討論

牙周病是多因素疾病，牙周微生物觸發(fā)的炎癥反應是牙周病的關鍵因素[10]。革蘭氏陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌是成人慢性牙周炎的重要病原體[11]，其主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），導致多種前炎癥介質的釋放[12]，并通過活化破骨細胞及抑制成骨細胞的成骨功能，加重骨質流失進而引發(fā)牙槽骨的吸收[13]。另一方面，慢性牙周炎與糖尿病之間存在密切的雙向關系[14-16]。糖尿病引發(fā)的牙周高血糖環(huán)境，AGEs的形成，組織氧化應激反應的增強，易可活化NF-κB信號途徑，導致大量前炎癥因子的釋放，誘發(fā)慢性炎癥[17]。高血糖環(huán)境導致的免疫-炎癥應答紊亂，活化了機體固有免疫系統(tǒng)，上調前炎癥介質，進而加重牙周破壞[18]。

本研究采用55 mg/kg STZ腹腔注射，72 h后大鼠的血糖水平≥16.7 mmol/L，血糖追蹤12 周，STZ 組大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L，表明成功建立了糖尿病大鼠模型。鏈脲佐菌素STZ 是一種廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤的用途[19]，因其可被胰島β細胞表面的葡萄糖轉運蛋白GLUT2 轉運至β細胞內，因此對實驗動物胰島β細胞具有特異性損傷，誘導產(chǎn)生1 型糖尿病[20]。對建模12 周后的STZ 組大鼠上頜骨進行HE染色分析，可見STZ組大鼠牙齦呈明顯的炎癥細胞浸潤，牙槽骨邊緣觀察到骨吸收陷窩，CEJ-ABC較對照組降低。Micro-CT分析顯示，STZ組骨小梁數(shù)量（Tb.N）下降，骨小梁間距（Tb.sp）較對照組顯著升高，掃描成像亦可見明顯的牙槽骨吸收。Micro-CT及HE染色結果一致，均呈現(xiàn)了STZ組大鼠牙槽骨吸收。以上結果證實，單純的血糖水平增高亦可導致大鼠實驗性牙周組織破壞。

研究分別采用Micro-CT和HE染色對糖尿病大鼠上頜骨模型進行分析。相較于傳統(tǒng)的HE 染色方法，組織進行Micro-CT前不需要脫鈣等繁瑣的標本處理過程，對樣本損傷小。實驗中Micro-CT 骨微結構參數(shù)選用了骨小梁數(shù)量Tb.N 和骨小梁間距Tb.Sp。Tb.N 通過計算單位長度內骨組織與非骨組織的交點數(shù)量評價每毫米內的骨小梁數(shù)量；Tb.Sp 通過計算骨小梁之間髓腔的平均寬度評價骨小梁間隙。Tb.N和Tb.Sp，通過對松質骨骨小梁結構進行分析，以動態(tài)的眼光定量分析STZ誘導的糖尿病大鼠牙槽骨改變。顯然，Micro-CT能夠通過自身處理軟件重構獲得骨內部詳細的圖像，進行精準性定量分析，在骨微結構分析方面具有明顯優(yōu)勢。該方法作為一種準確、快速、高分辨率的觀測方法，適用于大鼠牙槽骨分析。

4 結論

本實驗通過STZ 建立大鼠糖尿病模型，同時利用Micro-CT技術呈現(xiàn)牙周骨組織微結構，獲得精確參數(shù)，為后續(xù)糖尿病牙槽骨的研究奠定基礎。