劉甜甜，楊舒涵，顏 梅，俸瑞璟，鄧 莉

（西南醫(yī)科大學(xué)：1臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)；2口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)；3醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州 646000）

隨著生活水平的提高及受中國(guó)餐桌酒文化的影響，人們短期內(nèi)急性大量飲酒、醉酒的情況時(shí)有發(fā)生，這對(duì)肝細(xì)胞有明顯的毒害作用，易造成急性酒精性肝損傷，從而直接或間接導(dǎo)致酒精性肝病（alco?holic liver disease，ALD）的發(fā)生。ALD 早期常表現(xiàn)出脂肪肝等癥狀，若不及時(shí)加以控制，可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至導(dǎo)致肝功能衰竭；而在疾病的晚期，肝移植通常是唯一的解決辦法[1-2]。目前臨床上一般采取戒酒和給予藥物來(lái)進(jìn)行綜合干預(yù)，但患者對(duì)戒酒的依從性較差，而許多相關(guān)的治療藥物毒副作用又較大[3]。故通過(guò)尋找解酒保肝成分來(lái)有效緩解酒精對(duì)肝臟的損害，早期控制對(duì)酒精性肝病具有重要意義。

檸檬含有豐富的檸檬烯、類黃酮化合物、維生素C、檸檬酸及多種微量元素，是一種營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值都很高的水果，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗腫瘤、殺菌等生理活性功能。有資料[4-8]表明檸檬中含有的檸檬烯、類黃酮化合物及維生素C 等成分都單獨(dú)對(duì)肝臟有一定保護(hù)作用，但是包含這些總成分的檸檬提取物對(duì)肝臟的作用效果如何卻未見相關(guān)報(bào)道。而水飛薊素是從水飛薊果中提取的一種活性素，有清除活性氧，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)、再生等功能[9]，在臨床上常被用于治療慢性肝炎、肝硬化等疾病?？紤]到ALD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，各個(gè)影響因素之間相互關(guān)聯(lián)，用單一藥物治療可能有一定局限性，猜想聯(lián)合用藥可能對(duì)ALD 有更好的療效。因此，本研究對(duì)檸檬提取物和水飛薊素單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)急性酒精性肝損傷的干預(yù)效果進(jìn)行觀察，擬為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 成年大鼠45 只（200 ± 20 g），由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并通過(guò)動(dòng)物倫理審核。

1.2 藥物及試劑

52度紅星二鍋頭（北京紅星釀酒股份有限公司，批號(hào)20180623）；檸檬提取物（西安派頓生物科技有限公司，產(chǎn)品規(guī)格10∶1）；水飛薊素膠囊（德國(guó)馬博士大藥廠，批號(hào)20180521）；谷草轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒（AST，批號(hào)20180605）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒(ALT，批號(hào)20180615)、超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒(SOD，批號(hào)20180718)、丙二醛檢測(cè)試劑盒(MDA，批號(hào)20180713)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，型號(hào)DZKW-4），紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司，型號(hào)UV752N）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司，型號(hào)ELX808）。

1.4 動(dòng)物分組與處理

造模參照王筱婧等[10]的模型及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5 組：空白組、模型組、水飛薊素組、檸檬提取物組、聯(lián)合組（水飛薊素+檸檬提取物），每組9只。所有大鼠每日灌胃前禁食6 h，各組每天灌胃白酒或生理鹽水兩次（空白組每次按照0.5 mL/100 g 灌胃生理鹽水，其余各組每次按照0.5 mL/100 g灌胃52度紅星二鍋頭），兩次間隔1 h。白酒或生理鹽水灌胃后再間隔1 h，空白組和模型組按照1 mL/100 g 灌胃生理鹽水，水飛薊素組按照1 mL/100 g 灌胃水飛薊素（水飛薊素膠囊內(nèi)粉末狀藥品用蒸餾水按0.02 g/mL稀釋），檸檬提取物組按照1 mL/100 g灌胃檸檬提取物（采用0.5%吐溫80 溶液按照0.6 g/mL配制[11]），聯(lián)用組灌胃0.5 mL/100 g水飛薊素+0.5 mL/100 g檸檬提取物。一共灌胃8 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.5.1檢測(cè)血清中ALT、AST含量

末次灌胃后禁食不禁水20 h（次日），用3%的戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，開胸，在大鼠心臟取血2 mL，血樣室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存。按照試劑盒說(shuō)明書操作，用賴氏法檢測(cè)ALT、AST含量。

1.5.2計(jì)算肝臟系數(shù)及檢測(cè)MDA含量、SOD活力

將取出的肝臟用電子天平稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)（計(jì)算公式：肝臟重量／體重×100%）。取肝左葉組織約0.5 g，剪碎，加入4.5 mL生理鹽水制備成10%的肝勻漿，2 000 r/min離心15 min，重復(fù)3次，留取上清液，-20 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明書操作，用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。

1.5.3制備病理切片

在肝右葉同一部位，取一塊肝組織，用4%多聚甲醛固定，將固定24 h后的肝組織進(jìn)行石蠟包埋、切片（4 μm）、HE 染色處理。在光鏡下觀察肝組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并觀察脂滴在肝臟分布的面積和范圍，對(duì)肝組織脂肪化進(jìn)行評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)由SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法；單項(xiàng)有序的資料用等級(jí)秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較

如表1所示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST 含量均明顯升高（P <0.05）。與模型組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組和聯(lián)用組的大鼠血清中ALT、AST 含量均明顯的下降（P <0.01）。與單獨(dú)用檸檬提取物對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)相比，聯(lián)合組大鼠血清中ALT、AST含量下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 大鼠血清中ALT、AST含量的變化（）

表1 大鼠血清中ALT、AST含量的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05；b與聯(lián)用組相比，P<0.05

2.2 各組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量、SOD 活力比較

如表2所示，與空白組相比，模型組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量明顯升高（P <0.05），SOD 活力明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，水飛薊素組、聯(lián)用組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量降低（P <0.05）；聯(lián)用組大鼠肝組織勻漿液中SOD 活力升高（P<0.05）。與聯(lián)用組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力的變化（）

表2 大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05。

2.3 各組大鼠肝臟系數(shù)比較

如表3所示，與空白組相比，模型組大鼠的肝臟重量未見顯著變化，而體重明顯下降（P<0.05），肝臟系數(shù)明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組和聯(lián)用組的動(dòng)物體重增加（P<0.05），肝臟系數(shù)明顯下降（P<0.05），聯(lián)用組與兩個(gè)單獨(dú)干預(yù)組之間的肝臟系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠肝臟系數(shù)的變化（）

表3 各組大鼠肝臟系數(shù)的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05。

2.4 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化情況

如圖1所示：空白組肝臟被膜完整，肝索排列整齊，門管區(qū)結(jié)構(gòu)未見明顯纖維組織增生，亦未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。其余各組均出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞空泡變性、脂肪變性，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等和大小不等的微小空泡狀或細(xì)小顆粒狀物質(zhì)。對(duì)大鼠肝組織進(jìn)行脂肪變性評(píng)級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[12]。經(jīng)秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果如表4 所示，不同組間肝細(xì)胞脂肪變性程度有所不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=76.5，62.5，60，69；P=0.001，0.039，0.065，0.007）與空白組相比，模型組肝細(xì)胞脂肪變性程度加重。與模型組相比，水飛薊素組、聯(lián)用組肝細(xì)胞脂肪變性程度有所減輕；聯(lián)用組的肝細(xì)胞變性程度與兩個(gè)單獨(dú)干預(yù)組相比無(wú)差異。

表4 大鼠肝組織病理學(xué)變化

圖1 ↘肝細(xì)胞脂肪變性

3 討論

肝臟是人體酒精代謝的主要器官，但肝臟的代謝能力是有限的。一般而言，2周內(nèi)有暴飲史(乙醇量≥80 g/d)或超過(guò)5 年平均男性乙醇量≥40 g/d，女性乙醇量≥20 g/d（乙醇量（g）換算公式=飲酒量（mL）×乙醇含量（%）×0.8），即可造成酒精性肝損傷，增加酒精性肝病(ALD)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是存在于肝臟中的酶，在肝細(xì)胞受損及膜通透性增加的情況下，會(huì)從肝臟溢出到血清，且在血清中的含量與肝臟受損程度呈正比[14]，能很好反映肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性[15]；肝組織病理切片能較直觀地觀察肝細(xì)胞變性壞死、肝索排列等情況，從而反映肝臟的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清AST、ALT水平升高，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，且指標(biāo)變化都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示急性酒精中毒模型建立成功。而相比于模型組，各干預(yù)組的AST、ALT含量都有顯著的下降，病理切片示肝細(xì)胞脂肪變性程度有所減輕，表明檸檬提取物和水飛薊素能穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，減輕肝組織病變，緩解酒精對(duì)肝臟的損傷。

ALD 受多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的因素影響，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而氧化應(yīng)激及其誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用[16]。機(jī)體活性氧簇主要是通過(guò)細(xì)胞色素P450-2E1(CYP2E1)誘導(dǎo)產(chǎn)生，在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在活性氧清除劑，可以清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。但是大量飲酒導(dǎo)致CYP2E1活性增強(qiáng)，使活性氧產(chǎn)生增加，抗氧化物質(zhì)被大量消耗，體內(nèi)的氧化-抗氧化機(jī)制失去平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)等分子的氧化損傷，從而影響細(xì)胞呼吸功能及ATP 生成，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡[17-18]。而過(guò)量的氧自由基也會(huì)導(dǎo)致線粒體及肝細(xì)胞等部位的生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而誘導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，激活Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，促使肝臟纖維化的發(fā)生[19]；還會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)和通透性，影響其功能，如線粒體受損會(huì)使肝細(xì)胞對(duì)脂肪酸的分解功能降低，引起肝細(xì)胞脂肪堆積[20]。超氧化物歧化酶(SOD)是活性氧清除劑，其活力高低可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量可衡量肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，對(duì)比空白組，模型組大鼠的肝臟MDA 水平升高、SOD 活性下降，進(jìn)一步提示實(shí)驗(yàn)造模成功。用檸檬提取物進(jìn)行干預(yù)后，檸檬提取物組大鼠的MDA 含量降低、SOD 活性增加，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而聯(lián)用水飛薊素時(shí)，聯(lián)用組的MDA水平降低、SOD活性升高（P<0.05），提示單獨(dú)應(yīng)用檸檬提取物對(duì)肝臟的保護(hù)作用較弱，而檸檬提取物和水飛薊素聯(lián)合應(yīng)用在減少酒精對(duì)人體的影響、保護(hù)肝臟方面有一定的協(xié)同作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)氧自由基的清除，抑制超氧陰離子毒性，減輕氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

肝臟系數(shù)是毒理實(shí)驗(yàn)常用指標(biāo)，其值的變化可以粗略反映肝臟的病變類型，如系數(shù)增大表明肝臟可能脂肪變性或增生肥大，反之則表明肝臟萎縮或其他退行性改變[21]。與模型組相比，模型組的肝臟系數(shù)值雖比干預(yù)組大（P<0.01），但分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：干預(yù)組與模型組間的大鼠肝臟重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝臟系數(shù)有顯著差異是由體重變化導(dǎo)致的。推測(cè)此現(xiàn)象是因?yàn)榫凭绊懘笫蟮氖秤蛳眨勾笫篌w重明顯下降，且此次實(shí)驗(yàn)周期短，實(shí)驗(yàn)可能在肝臟重量沒(méi)有下降或下降趨勢(shì)不明顯時(shí)已結(jié)束，故肝臟重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)論

單獨(dú)應(yīng)用檸檬提取物對(duì)肝臟的保護(hù)作用較弱，而聯(lián)合應(yīng)用檸檬提取物和水飛薊素對(duì)保護(hù)肝臟有一定的協(xié)同作用，在穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、減輕肝細(xì)胞脂肪變性等方面有一定價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)有助于相關(guān)制劑臨床價(jià)值的挖掘，為ALD 的早期防治提供了一個(gè)新思路，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。