譚 鵬，周永峰，黃浩洲，朱 薇，包曉明，林俊芝，張定*，趙軍寧

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

2.島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，四川 成都 610023

3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072

4.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川 成都 610041

訶子Chebulae Fructus又叫訶黎勒，為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)，味酸、澀，功能澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽，臨床用于久瀉久痢、肺虛喘咳、咽痛音啞等癥[1]。訶子在藏成藥中使用廣泛，享有“藏藥之王”的美譽(yù)[2]?，F(xiàn)代研究表明，訶子具有抗氧化[3-5]、抗菌[6-7]、抗腹瀉[8]、修復(fù)肝損傷[9-10]等多種藥理作用，具有較高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

訶子藥材聞起來(lái)有一種“酸”的嗅覺(jué)，但訶子散發(fā)出的這種“酸”氣中含有哪些化學(xué)成分，其“酸氣”強(qiáng)度與其質(zhì)量差異是否存在關(guān)聯(lián)性等方面尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道?？陀^量化評(píng)價(jià)中藥材的揮發(fā)性成分是一個(gè)難點(diǎn)，主要在于缺少一些高通量、準(zhǔn)確、快速、實(shí)用的分析手段。頂空-固相微萃?。╤ead space-solid phase micro-extraction，HS-SPME）是一種樣品前處理技術(shù)，集提取、富集、解吸和進(jìn)樣等步驟于一身，具有操作簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，避免使用有機(jī)溶劑等特點(diǎn)。HS-SPME 技術(shù)適合分析易揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)，它能全面快速地獲得樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的組成信息[11-12]。本研究嘗試基于頂空-固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS）建立一種訶子藥材揮發(fā)性快速分析方法，辨識(shí)訶子“酸氣”中的化學(xué)成分，探討不同產(chǎn)地訶子之間的揮發(fā)性成分差異，以期從訶子揮發(fā)性成分分析的角度為訶子的質(zhì)量差異評(píng)價(jià)提供客觀數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TQ8050 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（Shimadzu，日本），配備PAL 加熱磁力攪拌模塊，數(shù)據(jù)分析軟件配備 Off-flavor-TQ-MS 數(shù)據(jù)庫(kù)；PAL SPME Arrow 固相微萃取進(jìn)樣器（1.5 mm×120 μm×20 mm，PN：ARR15-DVB/C-WR-120/20CT，CTC Analytics AG，Switzerland），PAL SPME Fiber 固相微萃取進(jìn)樣器（95 μm×10 mm，Carbon WR Fiber，PN： FIB-C-WR-95/10， CTC Analytics AG ，Switzerland），XPE26 電子天平（Mettler Toledo 公司，瑞典）。

1.2 試藥

苯乙酮（2 μg/mL，批號(hào)48292，Sigma 公司）、萘（5 μg/mL，批號(hào)40053，Sigma 公司）、2,6-二氯苯酚（2 μg/mL，批號(hào)40302，Sigma 公司）、2,4,6-三氯苯甲醚（2 μg/mL，批號(hào)47526-U，Sigma 公司）4 種化合物用于評(píng)估系統(tǒng)適應(yīng)性。4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合溶液（2 mg/mL，批號(hào)47358-U，Sigma-Aldrich 公司），苊-d10（2 mg/mL，批號(hào)48417，Sigma-Aldrich 公司）3 種化合物用作內(nèi)標(biāo)物。

1.3 藥材

21 批次訶子藥材來(lái)自于印度、印度尼西亞、越南、緬甸和中國(guó)云南省臨滄市等地，樣品均由成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院文永盛主任中藥師鑒定為訶子Terminalia chebulaRetz.。具體樣品信息見(jiàn)表1。

表1 21 個(gè)訶子樣品的采集信息Table 1 Details of 21 Chebulae Fructus samples

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件

色譜柱為InertCap Pure-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為5∶1，進(jìn)樣口壓力為83.5 kPa；載氣為高純氦氣，載氣控制方式為恒壓力模式；吹掃流量為3.0 mL/min；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min；柱平衡時(shí)間為2.0 min。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電子轟擊源（EI），離子化能量70 eV，離子源溫度為200 ℃，質(zhì)譜傳輸接口溫度為250 ℃，碰撞氣為氬氣；質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM），檢測(cè)器電壓相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果＋0.3 kV，溶劑延遲時(shí)間為1.3 min。各化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）見(jiàn)表2。為提高檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各化合物。

2.3 頂空-固相微萃取條件

訶子樣品碎粉成細(xì)粉（過(guò)三號(hào)篩），準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g，置于20 mL 惰性化頂空瓶?jī)?nèi)，50 ℃平衡40 min。進(jìn)樣前后，固相萃取頭在270 ℃老化裝置中自動(dòng)老化3 min，通過(guò)聚四氟乙烯隔墊插入頂空瓶?jī)?nèi)，不接觸樣品，在50 ℃恒溫下萃取吸附10 min 后，抽出萃取頭，迅速插入在預(yù)運(yùn)行狀態(tài)下的GC-MS 進(jìn)樣口，于250 ℃狀態(tài)下解吸2 min 后，進(jìn)行GC-MS/MS 分析。

表2 153 個(gè)化合物（包含3 個(gè)內(nèi)標(biāo)物）的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓參數(shù)Table 2 Monitoring ion pairs and collision voltage parameters of 153 compounds

續(xù)表2

續(xù)表2

2.4 供試品定性定量方法

先精密吸取苯乙酮、萘、2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚等4 種化合物的混合對(duì)照溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4 種化合物的對(duì)照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得）進(jìn)樣分析，評(píng)估儀器系統(tǒng)的適用性。再精密吸取4-溴氟苯、1,2-二氯苯-d4、苊-d10 等3 種內(nèi)標(biāo)物的混合溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合對(duì)照品溶液、苊-d10 對(duì)照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用移液器精密吸取此混合溶液50 μL 加入1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得）進(jìn)樣分析，獲得內(nèi)標(biāo)物的峰面積。最后再按照上述條件測(cè)定樣品。目標(biāo)化合物的定性是根據(jù)定性定量離子對(duì)確認(rèn)，目標(biāo)化合物的定量是根據(jù)島津TQ8050 再解析軟件內(nèi)150 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合內(nèi)標(biāo)物的實(shí)測(cè)峰面積來(lái)定量。

2.5 訶子揮發(fā)性成分定性分析

定性分析結(jié)果顯示，從訶子藥材中共篩查出86 種揮發(fā)性化合物，按化合物結(jié)構(gòu)可分為11 類(lèi)，包括酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、烯類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)、苯類(lèi)、醚類(lèi)、吡嗪類(lèi)、酰胺類(lèi)等。典型的訶子18 號(hào)供試品MRM 監(jiān)測(cè)總離子流圖（TIC）見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 典型的訶子18 號(hào)供試品MRM 監(jiān)測(cè)TIC 圖Fig.1 Typical total ion chromatogram of Chebulae Fructus sample yp18

表3 9 個(gè)代表性訶子樣品中揮發(fā)性成分篩查與定量分析結(jié)果Table 3 Results of odor screening and quantitative analysis of nine Chebulae Fructus samples

續(xù)表3

2.6 訶子揮發(fā)性成分定量分析

利用內(nèi)標(biāo)法對(duì)訶子中篩查出的86 種揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定量分析，需要指出的是，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用的是數(shù)據(jù)庫(kù)里的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合實(shí)測(cè)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積進(jìn)行定量分析，因此實(shí)驗(yàn)中對(duì)86 種化學(xué)成分的定量只是“半定量”。由于版面篇幅限制，表3 中列出了不同產(chǎn)地代表性訶子樣品的定量測(cè)定結(jié)果。

2.7 不同產(chǎn)地的訶子揮發(fā)性成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

鑒于測(cè)定的樣本量和揮發(fā)性成分較多，數(shù)據(jù)量較大，為了探討能否通過(guò)揮發(fā)性成分來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)地訶子，采用SIMCA-P 14.1 軟件對(duì)不同產(chǎn)地訶子的86 種化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果進(jìn)行PCA。同時(shí)考慮到不同產(chǎn)地的訶子外觀性狀差異較大，以訶子的外觀性狀作為分組原則，以黃棕色且有棱的越南和中國(guó)臨滄永德產(chǎn)訶子作為一組，以黑色且有深皺紋的緬甸和中國(guó)臨滄永康產(chǎn)訶子為一組，以暗棕色且無(wú)皺紋的印度尼西亞和印度產(chǎn)訶子為1 組，將各組樣品的86 種揮發(fā)性物質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入軟件分析。樣本間的得分圖顯示，不同產(chǎn)地之間的訶子有一定的區(qū)分，但區(qū)分不明顯，見(jiàn)圖2。以越南和中國(guó)云南臨滄產(chǎn)訶子為例，兩者在外觀性狀上差異較?。▋H有金黃色顏色深淺差異），2 個(gè)產(chǎn)區(qū)的訶子在PCA 分析過(guò)程中組間區(qū)分度較小，但與其它產(chǎn)區(qū)的訶子組間區(qū)分度較大。組間區(qū)分結(jié)果能夠與產(chǎn)地分組基本吻合，這提示不同產(chǎn)地的訶子中揮發(fā)性成分可能存在地域特征差異，但仍需大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 不同產(chǎn)地的訶子樣品中86 種揮發(fā)性化學(xué)成分含量PCA 分析圖Fig.2 Results of PCA of 86 volatile compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

載荷散點(diǎn)圖（圖3）顯示了不同揮發(fā)性化學(xué)成分對(duì)產(chǎn)地區(qū)分的貢獻(xiàn)度大小，其中貢獻(xiàn)度較大的化學(xué)成分或許可作為辨識(shí)不同產(chǎn)地訶子的特征性化合物。以貢獻(xiàn)度最大的化學(xué)成分α-松油醇（63 號(hào)）為例，其在21 個(gè)樣本中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.40 pg/g，但在不同產(chǎn)地分組中的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，分別為0.11（印度尼西亞＋印度）、0.62 pg/g（越南＋中國(guó)臨滄永德）、0.25 pg/g（緬甸＋中國(guó)臨滄永康）；箱式圖顯示了α-松油醇在各組含量分布的離散情況，表明其在緬甸、中國(guó)臨滄永康產(chǎn)的訶子樣本中含量分布差異較大，是影響產(chǎn)區(qū)識(shí)別的主要成分。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙酸的含量明顯高于其余85 個(gè)揮發(fā)性成分的含量，其在21個(gè)樣本中的含量平均值為89.79 pg/g，但其對(duì)產(chǎn)區(qū)識(shí)別的貢獻(xiàn)度并不大，箱式圖顯示其在樣本間的含量分布差異大小為緬甸＋中國(guó)臨滄永康＞印度尼西亞＋印度＞越南＋中國(guó)臨滄永德，見(jiàn)圖4。

圖3 不同產(chǎn)地的訶子樣品中86 種揮發(fā)性化學(xué)成分含量PCA 載荷散點(diǎn)圖Fig.3 Loading scatter plot of PCA analysis of 86 volatile chemical compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

圖4 不同產(chǎn)地的訶子樣品中α-松油醇和乙酸含量分布情況Fig.4 Content distribution of α-terpineol and acetic acid in Chebulae Fructussamples from different regions

3 討論

實(shí)驗(yàn)中比較了SPME Arrow 和SPME Fiber 2種固相微萃取進(jìn)樣器對(duì)訶子中揮發(fā)性成分的萃取效率和檢測(cè)靈敏度。和SPME Fibe 相比，SPME Arrow 樣品萃取時(shí)間顯著縮短，減少了轉(zhuǎn)移過(guò)程中分析物的損失，使得檢測(cè)靈敏度高于 SPME Fiber，因此最終優(yōu)選SPME Arrow 作為本實(shí)驗(yàn)的固相微萃取進(jìn)樣器。訶子的化學(xué)成分主要有鞣質(zhì)類(lèi)[13-15]、三萜類(lèi)[16-17]、黃酮類(lèi)[18]等。有文獻(xiàn)報(bào)道訶子藥材中含有揮發(fā)性成分[19-20]，本研究進(jìn)一步明確了訶子藥材中至少有86 種揮發(fā)性成分，按化合物結(jié)構(gòu)可分為酯、酮、醛、烯、酚、酸、醇、苯、醚、吡嗪、酰胺11 類(lèi)，且主要為脂溶性成分，豐富了訶子藥材的化學(xué)成分研究。訶子藥材中含有大量乙酸、月桂酸等有機(jī)酸類(lèi)成分，總體表現(xiàn)出“酸”的復(fù)合嗅氣。不同產(chǎn)地之間的訶子中揮發(fā)性成分的種類(lèi)基本一致，但在含量上存在一定差異，提示不同產(chǎn)地的訶子中揮發(fā)性成分的累積可能存在地域特征，但仍需用大樣本量數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)基于HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS 技術(shù)建立了一種訶子中150 種揮發(fā)性成分快速篩查和定量分析方法，具有高通量、快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，對(duì)其它中藥材的揮發(fā)性成分分析具有參考價(jià)值。

志謝：成都市荷花池中藥材市場(chǎng)楊定明對(duì)樣品收集做出的貢獻(xiàn)，成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院文永盛主任中藥師和成都市三勒漿藥業(yè)集團(tuán)樊三虎高級(jí)工程師對(duì)樣品鑒定做出貢獻(xiàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突