黎斯敏，左紫梅，詹若挺，何 瑞

廣州中醫(yī)藥大學中藥學院（中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院）廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部 重點實驗室 國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006

SKP1（S-phase kinase associated protein 1）蛋白在真核生物中普遍存在，其主要功能是結(jié)合F-box 蛋白和Cullin 蛋白形成SKP1-Cullin-F-box（SCF）復合體，參與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化降解過程[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多種SCF 復合體參與酵母和哺乳動物的眾多重要生物過程[2]，除此之外，SCF 復合體還能影響植物的生長發(fā)育，如赤霉素[3]、生長素（Auxin）[4]、獨腳金內(nèi)酯（SLs）[5-6]和茉莉酸[7]等激素的信號轉(zhuǎn)導過程和花的發(fā)育[8]、生物鐘[9]、光信號[10]、細胞分裂過程[11]等。泛素化過程需要泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的參與，其中E3 能特異性識別不同的底物。SCF 復合體是最常見的一類E3 泛素化連接酶[12]，一般由SKP1 蛋白、Cullin 蛋白、Rbxl 4 蛋白和F-box 蛋白組合而成[12]，其中SKP1 蛋白起到橋梁作用，能分別結(jié)合不同的F-box 和Cullin蛋白[13]。SKP1 蛋白由約170 個氨基酸殘基組成，C端具有8 個α 螺旋結(jié)構(gòu)（H1-H8），N 端具有的α/β 超二級結(jié)構(gòu)類似于BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域的折疊方式[14]。SKP1 是一類較為保守的蛋白家族，該蛋白在人[15]和酵母[16]中都只有一個，但線蟲中至少有21 個SKP1相關(guān)蛋白（SKR）[17]，且其表達模式、Cullin 和F-box蛋白結(jié)合方式上均有不同。SKP1在眾多植物中都不止1 個成員，如擬南芥中預測得到21 個SKP1同源基因[18]。目前已從擬南芥Arabidopsis thaliana(L.) Heynh[19]、水稻Oryza sativaL.[20]、蘭花CymbidiumL.[21]、煙草Nicotiana tabacumL.[22]、大豆Glycine max(Linn.) Merr.[23]、黃瓜Cucumis sativusL.[24]、草莓Fragaria×ananassaDuch.[25]等植物中克隆得到SKP1同源基因并對其功能進行了不同程度的研究，其中對擬南芥ASK1基因的研究較為深入。

青天葵又名獨葉蓮、珍珠草，來源于多年生蘭科植物毛唇芋蘭Nervilia fordii(Hance) Schltr.的葉或全草，具有清熱潤肺、解毒消腫等功效，主治肺癆咯血等疾病，臨床上常用于治療小兒呼吸道感染等肺部疾病[26]。由于青天葵生長環(huán)境要求較苛刻，且種子無胚乳，以無性繁殖為主，繁殖系數(shù)低。一般每年只生長1 片葉子，1～2 個塊莖。過度采挖和生態(tài)環(huán)境惡化導致青天葵的野生資源日漸匱乏[27-29]。目前尚未有關(guān)于青天葵中SKP1基因的報道，而本課題組前期已獲得青天葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[30]，從中挖掘并克隆SKP1同源基因，有助于了解其參與青天葵的生長發(fā)育等方面的調(diào)控機制。

本研究從青天葵葉片中克隆得到5個SKP1同源基因NSKs，對其進行生物信息學分析，并將其連接至pGEX-4T-2 原核表達載體上，在大腸桿菌Rosetta（DE3）中進行誘導表達，經(jīng)純化得到融合蛋白，為后期進一步探討NSKs 蛋白的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料、試劑及儀器

1.1 藥材

所用植物材料青天葵為廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所黃云峰副研究員采集并鑒定為蘭科植物毛唇芋蘭N.fordii(Hance) Schltr.，于廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心實驗室培育。

1.2 菌種及載體

大腸桿菌Escherichia coli菌株E.coliDH5α 感受態(tài)細胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；pLB Vector 購自天根生化科技（北京）有限公司；Rosetta (DE3) Chemically Competent Cell購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑

質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）、pLB 零背景快速克隆試劑盒（Lethal Based Fast Cloning Kit）、通用型 DNA 純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、DNA Markers、PrimeScript RT reagent Kit 均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；OminiPlant RNA Kit (DNase I) 購自北京康為世紀生物科技有限公司；PurKineTM谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶標簽蛋白純化試劑盒（谷胱甘肽）購自Abbkine；Pageruler Prestained Protein Ladder 購自Thermo；ProteinFind? Anti-GST Mouse Monoclonal Antibody、ProteinFind? Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate 和EasySee? Super Western Blot Kit均購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；液氮。

2 方法

2.1 青天葵葉片總RNA 的提取與cDNA 第一鏈的合成

參照OminiPlant RNA Kit （DNase I） 說明書提取青天葵葉片總RNA，用微量分光光度計測定其濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測葉片總RNA 的完整性。參照PrimeScript RT reagent Kit 說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設計18 S rRNA 引物18 S-F、18 S-R 進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2 青天葵NSKs 基因編碼區(qū)序列的克隆

將課題組前期建立的青天葵轉(zhuǎn)錄組注釋的 Unigenes 數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選到5 條與擬南芥ASK1基因序列高度同源的Unigenes 序列。將這5條Unigenes 分別命名為NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11。將NSK7和NSK11基因的堿基序列交由廣州天一輝遠基因科技有限公司進行全基因合成。同時設計基因特異性引物（表1），以“2.1”項下所得cDNA 為模板進行NSK2、NSK3、NSK5的開放閱讀框（ORF）擴增，反應總體積為10 μL：cDNA 0.2 μL；引物F/R 各0.2 μL；PrimeSTAR 5 μL；ddH2O 4.4 μL。擴增程序：94 ℃、2 min；98 ℃、10 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，38 個循環(huán)；72 ℃、7 min。目的片段經(jīng)回收純化后連接至pLB Vector，轉(zhuǎn)化至DH5α，經(jīng)菌液PCR 鑒定后，挑取陽性菌株送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

表1 所用引物Table 1 Primers used in this study

2.3 青天葵NSKs 蛋白的生物信息學分析

采用ExPASy-ProtParam 在線網(wǎng)站預測目的蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點等基本理化性質(zhì)；分別用SOPMA 和SWISS-MODEL 預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；采用Cell-PLoc 2.0 package 對蛋白進行亞細胞定位預測；利用NCBI 的BLASTP 和DNAMAN 對氨基酸序列進行同源檢索和比對，應用軟件MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用SignalP 4.1 Server 和TMHMM Server v 2.0 在線軟件分別預測信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.4 青天葵NSKs 原核表達載體構(gòu)建、蛋白表達純化及檢測

2.4.1 原核表達載體構(gòu)建 以“2.2”項下得到的含有NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 完整編碼區(qū)序列質(zhì)粒為模板，設計引物擴增目的基因片段（表1），反應總體積為100 μL：cDNA 2 μL；引物F/R各2.5 μL；PrimeSTAR 50 μL；ddH2O 43 μL。擴增程序：94 ℃、2 min；98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，38個循環(huán)；72 ℃、7 min。目的片段經(jīng)回收純化后得到NSKs片段；為便于檢測重組蛋白，用Infusion 酶將各NSK片段分別與經(jīng)SalI 和EcoRI 雙酶切后的pGEX-4T-2 載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，經(jīng)菌液PCR 鑒定后，挑取陽性菌株送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序，測序正確后提取質(zhì)粒。

2.4.2 蛋白表達純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）菌株，挑取單菌落于37 ℃過夜培養(yǎng)，用LB 液體培養(yǎng)基以1∶100 的比例擴大培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至A600達0.6～0.8，加入IPTG 至終濃度為0.2 mmol/L，轉(zhuǎn)入16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，每100 mL 菌液加入10 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），按PurKineTM谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）標簽蛋白純化試劑盒說明書進行純化，得到純化蛋白。分別取20 μL 純化蛋白，加入4×Loading buffer，100 ℃滅活10 min，用10%的分離膠進行SDS-PAGE 電泳檢測。

2.4.3 Western Blot 檢測 為了得到清晰的條帶，將純化得到的重組蛋白稀釋一定比例，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至已活化的Immobilon-E PVDF 轉(zhuǎn)印膜，將膜置于封閉液（用TBST 緩沖液配制5%脫脂奶粉），于搖床上振蕩孵育90 min；隨后加入Anti-GST Mouse mAb（1∶5000）于4 ℃過夜孵育，用洗膜液（1×TBS 加入0.1%聚山梨酯-20）洗滌5 次。在室溫條件下與Goat Anti-Mouse IgG/HRP（1∶10000）孵育1 h，再用洗膜液洗滌5 次，參照EasySee Western Blot Kit 說明書加入發(fā)光液，用全自動化圖像分析系統(tǒng)進行拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 青天葵NSKs 基因的克隆

通過本地Blast 從青天葵轉(zhuǎn)錄組中篩選得到5條具有完整ORF 的NSKs序列，將其分別命名為NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11。通過ORF Finder在線網(wǎng)站預測已知序列的ORF 片段，設計基因特異性引物進行擴增，克隆得到3 條NSKs基因，即NSK2、NSK3、NSK5，見圖1。NSK7和NSK11基因由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。

圖1 青天葵葉片總RNA (A) 和cDNA 的18S (B) 及NSKs(C) 擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of N.fordii leaves (A), 18S (B), and NSKsamplified from cDNA (C)

3.2 青天葵NSKs 蛋白的生物信息學分析

3.2.1 青天葵NSKs 蛋白的基本理化性質(zhì)、功能域預測和亞細胞定位預測 采用ExPASy-ProtParam 在線工具對NSKs 蛋白的基本理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，NSK2、NSK3、NSK5均為不穩(wěn)定的親水蛋白，而NSK7和NSK11 是穩(wěn)定的疏水蛋白，見表2。

Cell-PLoc 2.0 package 在線軟件對NSKs 的亞細胞定位預測表明NSK2、NSK3、NSK5 均定位于細胞核，而NSK7 和11 定位于細胞質(zhì)和細胞核。利用NCBI 預測NSKs 蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)NSK2、NSK3、NSK5、NSK7 和NSK11 均具有F-box、Cullin 蛋白的結(jié)合位點，且 N 端均具有類似BTB/POZ 折疊的約120 個氨基酸殘基的α/β 結(jié)構(gòu)。

3.2.2 青天葵NSKs 蛋白的高級結(jié)構(gòu)、信號肽和結(jié)構(gòu)域分析 用SOPMA 在線軟件對NSKs 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，發(fā)現(xiàn)5 個蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由四種形式組成，其中NSK3、NSK5、NSK7 和NSK 11中均是α-螺旋（alpha helix）＞無規(guī)卷曲（random coil）＞延伸鏈（extended strand）＞β 轉(zhuǎn)角（beta turn），而NSK2 的β 轉(zhuǎn)角＞延伸鏈，見表3。

用SWISS-MODEL 進行NSKs 蛋白建模，結(jié)果表明，NSK2、NSK3 和NSK5 的蛋白三級結(jié)構(gòu)高度相似，而NSK7 和NSK11 的蛋白三級結(jié)構(gòu)較為不同。前三者的模板為茉莉酸信號中的Coronatine-insensitiveprotein 1 和SKP1-like protein 1A、JAZ1 incomplete degron peptide 的復合體結(jié)構(gòu)，一致性均在75%左右，相似性均為 0.54；NSK7 參考模板是 S-phase kinase-associated protein 1 蛋白與F-box/LRRs -repeat protein 17 和Kelch-like ECH-associated protein 1 的復合體結(jié)構(gòu)，一致性為67.3%，相似性為0.5；NSK11參考模板為人的S-phase kinase-associated protein 1蛋白模型，一致性均為61.78%，相似性均為0.49；具體信息見圖2。

表2 青天葵NSKs 基本理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of NSKs proteins from N.fordii

表3 青天葵NSKs 蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息Table 3 Secondary structure information of NSK proteins from N.fordii

圖2 青天葵NSKs 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Prediction of three-dimensional structures of NSK proteins from N.fordii

根據(jù)SignalP 4.1 Server 在線軟件預測結(jié)果可知，NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 的信號肽平均值分別為0.000 6、0.000 8、0.000 6、0.000 6和0.001 3，均不具有信號肽及切割點，為非分泌蛋白。利用TMHMM Server v2.0 在線軟件對NSKs 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果表明三者均為膜外蛋白，無跨膜區(qū)。

3.2.3 青天葵NSKs 蛋白的同源比對及親緣進化樹分析 用DNAMAN 比對NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)5 者的同源性達到73.65 %。用NCBI 對NSKs 蛋白進行蛋白序列同源性檢索，選出同源性較高 SKP1 同源蛋白用MEGA 7.0 對其進行分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)青天葵NSK2、NSK3 和NSK5 聚為一簇，與小麥和玉米等的同源性較高，而NSK7 和NSK11 聚為一簇，與多頭絨泡菌的同源性較高。研究表明，盡管SKP1 蛋白廣泛存在于真核生物中，但該蛋白在進化上具有一定的保守性[19]。

圖3 不同植物中SKP1 蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SKP1 proteins from different plants

3.3 GST-NSKs 融合蛋白的表達純化

根據(jù)目的片段設計特異性引物擴增得到單一條帶，菌落PCR 及測序結(jié)果表明基因NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11成功插入到pGEX-4T-2 載體中（圖4）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 Rosetta（DE3）感受態(tài)中，經(jīng) IPTG 誘導表達GST 融合蛋白，用PurKineTM 谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶標簽蛋白純化試劑盒純化得到較純的 NSKs重組蛋白。

圖4 NSKs 原核表達載體構(gòu)建Fig.4 Construction of prokaryotic expression vectors of NSKs fused with GST-tag

SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果如圖5 所示，5 者均在約50 000 處出現(xiàn)目的蛋白。Western Blot 結(jié)果表明，純化的GST-NSKs 蛋白的條帶大小與預期的蛋白大小相符。

圖5 重組GST-NSKs 蛋白的純化及Western blot 檢測Fig.5 Purification of recombinant GST-NSK proteins and Western blot analysis

4 討論

SKP1基因廣泛存在于植物中，且植物中一般會存在多個SKP1基因。如擬南芥中有21 個表達模式和功能差異較大的SKP1同源基因（ASK1～ASK21），序列高度相似的ASK基因的表達水平和方式較為相似，部分ASK基因定位于核內(nèi)[18]。而單子葉植物水稻中也發(fā)現(xiàn)了18 個SKP1同源基因，從中克隆得到OSK1、OSK2、OSK3基因，OSK1是水稻內(nèi)具有管家功能的SKP1基因，而OSK2和OSK3則可能具有與OSK1不同的功能[20]。本研究從青天葵中克隆得到5 個SKP1同源基因，5 者相似性高達73.65%。亞細胞定位預測結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)的SKP1基因一致，均能在細胞核內(nèi)表達。而三級結(jié)構(gòu)預測及親緣進化樹結(jié)果均表明，NSK2、NSK3 和NSK5和玉米、小麥等單子葉植物的同源性較高，而NSK7和NSK11 與多頭絨泡菌聚為一簇，但二者的三級結(jié)構(gòu)較為不同。以上結(jié)果均表明，NSKs編碼SKP1 類蛋白，可能具有參與SCF 復合體的形成從而調(diào)控植物的生長發(fā)育的功能。在SCF 復合體的形成中NSK2、NSK3 和NSK5 蛋白的功能可能是相似的，而NSK7 和NSK11 的功能可能有些不同，還需進一步研究。

SKP1 蛋白能與F-box 蛋白結(jié)合，即結(jié)合不同激素信號受體蛋白結(jié)合形成多種SCF 復合體從而參與生長素、茉莉酸、獨腳金內(nèi)酯等植物激素的信號傳導過程[19]。如擬南芥中的ASK1 和ASK2 能分別與擬南芥的生長素受體TIR1 蛋白和擬南芥的茉莉酸受體COI1 蛋白互作形成SCF 復合體，而ASK11 和ASK12以及小粒水稻OmSKP1 也能與COI1 互作形成SCF復合體與泛素-蛋白酶體途徑蛋白降解[31-35]。此外，ASK1 與ORE9/MAX2 蛋白互作及水稻OSK1、OSK5、OSK20 與OsD3 互作從而參與獨腳金內(nèi)酯信號的傳導[5,36]。如上所述，SKP1 類蛋白能與不同的F-box 蛋白結(jié)合，有些SKP1 蛋白能與多種F-box蛋白結(jié)合，但結(jié)合作用強弱有所不同，而有些SKP1蛋白至今未能找到與其互作的F-box 蛋白[33,37]。本研究建立了適用于攜帶GST 標簽的NSKs 蛋白的原核誘導表達條件，經(jīng)Western Blot 檢測表明成功誘導并純化得到可溶性良好的、攜帶GST 標簽的NSKs 蛋白，后期可用于Pulldown 實驗驗證與之互作的F-box 蛋白。試驗中發(fā)現(xiàn)GST-NSK5 融合蛋白的表達量較另外4 者的低，可能是誘導時間不夠，后期蛋白功能驗證試驗可適當延長誘導時間，以提高目的蛋白的表達水平，獲得足量的蛋白。有學者從黃瓜中克隆得到Skp1基因并純化得到Skp1蛋白，利用該蛋白制備的抗血清能從黃瓜中提取得到的蛋白中檢測出Skp1 蛋白[24]。這為研究青天葵中NSKs蛋白功能提供了一定的研究思路，可進一步通過純化得到的NSKs 蛋白制備目的蛋白的特異抗體，檢測青天葵原植物中NSKs 的蛋白表達情況等。本研究表明從青天葵中克隆得到的5 個NSKs基因具有一定的保守性，五者在SCF 復合體中發(fā)揮的功能有待后續(xù)的深入研究驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突