郭英男，劉月?lián)P，馬靜雨，張 敬，馬鑫彤，張馨月，劉建雨，姚 娜，劉秀明，李海燕

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

紅花Carthamus tinctoriusL.為菊科紅花的干燥管狀花。辛、溫，歸心、肝經(jīng)。氣微香，味微苦。具有活血通經(jīng)、散瘀止痛功效。主治經(jīng)閉、痛經(jīng)、胸痹心痛、跌撲損傷和瘡瘍腫痛等[1]?！侗静菥V目》記載紅花汁與血同類，“故能行男子血脈，通女子經(jīng)水。多則行血，少則養(yǎng)血”[2]?，F(xiàn)代藥理、臨床研究證明，紅花具有擴張血管、抗凝血、抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、保護心腦血管、保護神經(jīng)、降壓和增強免疫等活性[3-6]。紅花花瓣最主要的活性化學(xué)成分是黃酮類化合物，主要分為黃酮類、黃酮醇類、醌式查耳酮類和二氫黃酮類。醌式查耳酮類的紅花黃色素（SY）占1/5～1/3[5-6]，是紅花的主要有效成分，有抗心肌缺血、擴張冠狀動脈、抑制血小板凝聚、促進血液循環(huán)、抗氧化、抗炎等藥理作用[7-9]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia- lyase，PAL）將苯丙氨酸脫氨轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸，該反應(yīng)是紅花黃酮類生物合成途徑的起始反應(yīng)，苯丙烷類合成代謝的關(guān)鍵酶。PAL 在植物發(fā)育過程中起作用，對苯基丙烷次生代謝產(chǎn)物進行調(diào)控，對多種環(huán)境刺激產(chǎn)生響應(yīng)[10-13]。PAL 通常是由小的多基因家族編碼[12]，PAL基因家族常含有的2～6 個家族成員（PAL1、PAL2 和PAL3 等）在植物中的表達具有組織特異性[13]，其相對分子質(zhì)量在220 000～340 000，是一種由4 個77 000～83 000 亞基構(gòu)成的寡聚酶[14-15]。PAL受內(nèi)部鈍化因子、調(diào)節(jié)因子和末端產(chǎn)物的調(diào)控，是一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)植物在受到病原體攻擊、機械損傷、紫外線照射、鹽分脅迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)PAL 編碼基因的表達[16]。

利用真核或原核微生物研究一個簡單的次生代謝產(chǎn)物的生物合成，至少需轉(zhuǎn)入多個植物外源基因才能實現(xiàn)[17]。并且利用原核微生物表達植物蛋白酶，尚存在缺乏輔助因子、蛋白折疊錯誤、宿主膜的插入和產(chǎn)生包涵體等問題[18-19]。因此，與微生物相比，植物細胞含有次生代謝產(chǎn)物合成和儲存的全部遺傳信息。紅花植株的生長周期為1～2年，故在整株植物水平上進行遺傳操作較困難，而組織培養(yǎng)產(chǎn)生再生植株則容易存在生根困難和再生率低等問題[20-21]，這極大地限制了紅花功能基因研究和紅花黃酮生物合成研究的進程。未分化的植物愈傷組織在受控的液體培養(yǎng)基中進行不斷攪動或搖動，可產(chǎn)生懸浮細胞。懸浮細胞具有增殖迅速、遺傳背景清晰、分散性好、可體外操作且易控制[20-22]的優(yōu)點，成為研究植物次生代謝產(chǎn)物及合成生物學(xué)必不可少的工具，可以作為體外大量合成植物次生代謝產(chǎn)物的良好生物反應(yīng)器[22]。

因此，建立轉(zhuǎn)基因紅花懸浮細胞遺傳體系，對進一步深入研究黃酮合成代謝調(diào)控具有重要的意義。目前，已有相關(guān)研究利用懸浮細胞，在基因和細胞水平上進行克隆表達，如利用煙草[23]、白樺[24]、雷公藤[25-27]、綠竹[28]、甘草[29]、蘋果[30]懸浮細胞，研究其功能基因在生長發(fā)育、次生代謝和環(huán)境適應(yīng)中的作用[31]。但是，通過紅花懸浮細胞研究苯丙烷類次生代謝關(guān)鍵酶基因的相關(guān)研究，尚無報道。本研究在紅花基因組測序基礎(chǔ)上，對紅花PAL家族進行全基因組分析，并建立了紅花懸浮細胞遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功構(gòu)建了對紅花PAL4（CtPAL4）基因表達載體，并初步在懸浮細胞中進行表達，一方面，為研究紅花PAL基因的功能，探討其在紅花黃酮次生代謝途徑中的作用奠定基礎(chǔ)；另一方面，為紅花懸浮細胞在功能基因、次生代謝調(diào)控及生物反應(yīng)器等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

樣品經(jīng)筆者鑒定為紅花Carthamus tinctoriusL.吉紅一號，于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程中心基地種植，于盛花期采集花瓣，錫箔紙包好液氮處理后，保存于-80 ℃冰箱備用。pCAMBIA 3301 植物表達載體由本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA 提取試劑盒，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶，購自Clontech 公司；LA Taq 酶等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；BglII、BstE II 等內(nèi)切酶，購自Thermo Scientific 公司；pEASY-T1 Simple Cloning Kit（CT111-01），購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自愛思進生物技術(shù)有限公司；T4 連接酶購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（蔗糖20 g/L、MS 粉4.33 g/L、肌醇0.1 g/L、有機營養(yǎng)液3.4 mg/L 和瓊脂粉8 g/L），有機營養(yǎng)液配方（甘氨酸0.4 g/L、煙酸0.1 g/L、鹽酸吡哆素0.1 g/L 和鹽酸硫酸素0.08 g/L）；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NAA 2 mg/L 和6-BA 0.5 mg/L）；繼代培養(yǎng)基（MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；懸浮細胞液體培養(yǎng)基（不加瓊脂粉的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；YEP 培養(yǎng)基（酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L 和氯化鈉5 g/L，如需固體YEP 則添加瓊脂粉8 g/L）；LB 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L 和酵母粉5 g/L）。

2 方法

2.1 紅花PAL 家族全基因組分析

從Pfam 數(shù)據(jù)庫下載PAL 蛋白保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型文件（PF00221），以PF00221 為探針，利用HMMER3.0 軟件在紅花基因組中檢索具有該結(jié)構(gòu)域的基因。利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，NCBI 的CDD（conserved domain database）數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)序列的功能結(jié)構(gòu)域進行分析預(yù)測。提取轉(zhuǎn)錄起始點上游2000～200 bp 序列，利用plantCARE 在線分析啟動子上游區(qū)域順式作用元件，并用TBtools 實現(xiàn)重要順式作用元件的可視化分析。利用CLSTAL X1.81 和MEGA 5.2 進行多重序列比對分析和聚類分析，構(gòu)建紅花PAL 家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2.2 紅花總RNA 提取及cDNA 合成

紅花（吉紅一號）盛花期花瓣總RNA 提取使用RNA 提取試劑盒（BioTeke 公司），按說明書進行操作，然后用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 第1 鏈，反轉(zhuǎn)錄cDNA 作為CtPAL4基因克隆模板。

2.3 CtPAL4 基因的克隆

根據(jù)紅花基因組測序結(jié)果，獲得紅花PAL基因的多條候選序列，將候選序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫其他植物進行同源性比對，將同源性高的序列（CtPAL4）作為候選基因進行克隆，基因的特異性引物序列為5’-ATGGATCAATACATGAGCAATGTTATGAAGA- AATAGGAAGTGG-3’。

以紅花花瓣cDNA 為模板進行編碼區(qū)序列的擴增，首先進行溫度梯度PCR，獲得最佳退火溫度。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，上游引物CtPAL4f（10 μmol/L） 1 μL，下游引物CtPAL4r（10 μmol/L） 1 μL，LA Taq 0.5 μL，水33.5 μL，總體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。凝膠電泳檢驗是否獲得目的條帶。擴增產(chǎn)物凝膠回收后連接T 載體進行測序。

2.4 CtPAL4 基因的生物信息學(xué)分析

利用WOLF PSORT 進行亞細胞定位分析，分別利用EXPASY-SOPMA 軟件和EXPASY-phyre2 進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析。利用DNAMAN 軟件進行多序列比對分析，用Conserved Domains Search（InterProScan）預(yù)測蛋白質(zhì)序列的功能結(jié)構(gòu)域，利用CLSTAL X1.81 進行系統(tǒng)進化樹分析。利用Tmpred 預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，利用ProtFun202 進行功能預(yù)測， ProtParam 軟件（http://web.expasy.org/）分析編碼蛋白的氨基酸序列的組成、相對分子質(zhì)量和等電點等理化性質(zhì)。

2.5 CtPAL4 基因植物表達載體的構(gòu)建

以pCAMBIA 3301（圖1）作為植物表達載體骨架，將測序正確的CtPAL4兩端分別引入酶切位點BglII 和BstE II，替換載體上的β-葡聚糖苷酶報告基因（GUS），構(gòu)建植物表達載體。以獲得的CtPAL4基因T 載體為模板，進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物凝膠回收后連接T 載體進行測序。對連有酶切位點的CtPAL4基因的T 載體和pCAMBIA 3301 載體分別進行雙酶切，建立200 μL 酶切體系，經(jīng)過4 h 酶切后，獲得的酶切產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒切膠回收CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 載體。將獲得的CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 載體用T4 DNA Ligase 酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)。次日，挑取白斑至10 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，200 r/min，37 ℃，培養(yǎng)8 h。提取質(zhì)粒進行PCR 和酶切鑒定，酶切鑒定正確的菌液進行測序。

圖1 pCAMBIA3301 表達載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of pCAMBIA3301 expression vector

2.6 工程農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

驗證正確的質(zhì)粒1 μL，加入到EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴30 min。液氮冷凍5 min，37 ℃水浴，熱擊5 min。在離心管中加入1 mL 不加抗生素的YEP 液體培養(yǎng)基，混勻后放于搖床中，28 ℃，200 r/min 振蕩4 h。5000 r/min 離心6 min。離心后加入200 mL YEP 液體培養(yǎng)基進行重懸。取重懸后的菌體涂在含有10 mg/L 利福平的YEP 固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待長出菌落后，挑取單菌落，于10 mg/L 利福平的YEP 液體培養(yǎng)基的試管中， 過夜培養(yǎng)后進行菌液PCR 驗證，將驗證正確的菌液加入甘油，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 紅花懸浮細胞遺傳體系的建立

利用實驗室已建立的體系獲得紅花懸浮細胞[19]，將紅花種子接種到MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)出無菌苗；無菌苗子葉外植體接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 代。挑選質(zhì)地疏松、不透明且淡黃色的愈傷組織[32]用于遺傳轉(zhuǎn)化。按照設(shè)計的實驗組別進行遺傳轉(zhuǎn)化實驗，每個組別進行3 次平行實驗。三角瓶開口放一漏斗，漏斗上覆蓋空氣濾膜。三角瓶放于真空干燥罐內(nèi)真空處理，調(diào)節(jié)空氣壓力至10、20、30 kPa，分別在15、10、7 min 內(nèi)緩慢地釋放壓力，完成侵染過程。過濾除去液體培養(yǎng)基，濾紙吸收多余工程農(nóng)桿菌，洗菌后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 或4 天。使用羧芐（0、75 mg/L），頭孢（100 mg/L）和草甘膦（0.50、0.75、1.00、1.25 mg/L）對遺傳轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行壓力篩選，每個組別進行3 次平行實驗。

對獲得的愈傷組織進行GUS組織化學(xué)分析[34]。利用含有GUS基因pCAMBIA3301 的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染紅花愈傷組織，在轉(zhuǎn)化后15 d，進行GUS 染色，將紅花愈傷組織浸泡在含有1 mmol/L X-Gluc [溶于0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和30% Triton X-100] 的GUS 染色液中，37 ℃暗培養(yǎng)過夜。分析前，用95%乙醇脫色除去葉綠素。在Olympus顯微鏡下，觀察轉(zhuǎn)基因愈傷組織中GUS基因瞬間表達產(chǎn)物（β-葡聚糖苷酶）對底物的水解情況。

2.8 轉(zhuǎn)CtPAL4 基因紅花懸浮細胞的PCR 鑒定

選取質(zhì)地疏松且分散性好的胚性愈傷組織接種到懸浮細胞液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)，避光搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，獲得紅花懸浮細胞。吸取連續(xù)繼代3代的轉(zhuǎn)基因紅花懸浮細胞，經(jīng)孔徑100 目鎳網(wǎng)過濾，過濾物0.5 g 提取基因組，用于PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅花PAL 家族全基因組分析

在紅花基因組測序結(jié)果中，共注釋到紅花PAL家族6 個基因。利用NCBI 的CDD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)序列的功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，5 個（CtPAL1～5）紅花PAL 基因均具有PAL 家族的典型結(jié)構(gòu)域（MIO結(jié)構(gòu)域）及活性位點（圖2-A），且含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）。使用plantCARE 在線分析順式作用元件，并用TBtools 對紅花PAL家族基因啟動子中選定的9個重要順式作用元件進行可視化分析（圖2-B）。啟動子區(qū)域包含多個典型啟動子核心調(diào)控元件、激素響應(yīng)元件和植物逆境脅迫響應(yīng)元件。9 個順式作用元件分別為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-Motif）、防御及脅迫響應(yīng)元件（TC-rich）、分生組織表達元件（CAT-box）、光響應(yīng)元件（G-box）、光響應(yīng)元件（MRE）、MYBHv1 結(jié)合位點（CCAAT-box）、MBSI（類黃酮合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點）、AAGAA-motif。

利用DNAMAN 軟件將6 個紅花PAL家族基因與大麥、擬南芥和水稻等的基因進行同源性比較分析，并利用軟件MEGA 5.2 鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明：80 個PAL序列明顯聚成5 個分支，6 個紅花PAL 家族基因單獨聚在一個進化枝，同時與擬南芥（AT3G53260.1，AT2G37040.1）聚集在相同的分支，說明紅花與擬南芥PAL基因家族的親緣關(guān)系較近。其中，CtPAL4單獨聚在一個分支上，說明在紅花植株中CtPAL4可能與其他PAL基因行使不同的功能。因此，本研究將CtPAL4基因作為后續(xù)研究對象。

圖3 紅花PAL 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Carthami Flos PAL family genes

3.2 紅花總RNA 的提取

選擇紅花花瓣作為材料，提取總RNA。提取后的RNA 使用Nanodrop2000 進行RNA 濃度檢測，其濃度為1368 μg/μL，A260/A280的比值為1.92，A260/230的比值為1.94。由此可見提取的RNA 樣品純度較高。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中28 S、18 S、5 S條帶清晰可見，無明顯拖尾現(xiàn)象（圖4），說明所獲得RNA 樣品完整性較好。綜上，所提取的紅花總RNA 純度較高、完整性較好，可用于反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 實驗。

圖4 紅花花瓣 (A) 及RNA 提取 (B) 電泳結(jié)果Fig.4 Total RNA agarose gel electrophoresis and petals from Carthami Flos

3.3 CtPAL4 基因的克隆

根據(jù)基因組中獲得的CtPAL4基因編碼區(qū)序列，以反轉(zhuǎn)錄的紅花花瓣cDNA 為模板，首先進行溫度梯度PCR 驗證（圖5-A），利用CtPAL4f 和CtPAL4r特異性引物進行PCR 擴增，結(jié)果顯示，退火溫度58 ℃時，在2000～4000 bp 位置擴增出目的片段，條帶較亮且特異，說明設(shè)計的該對引物特異性良好。將目的基因片段膠回收后與T1 連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液PCR 電泳驗證（圖5-B）有目的條帶出現(xiàn)，對含有目的條帶的大腸桿菌提取質(zhì)粒，用BamHI和EcroI酶過夜雙酶切。產(chǎn)物電泳檢測（圖5-C），將鑒定正確的菌液送蘇州金唯智公司測序，測序結(jié)果獲得2124 bp 的目的序列，測序結(jié)果與原序列吻合，因此將其命名為CtPAL4。

圖5 CtPAL4 基因編碼區(qū)克隆Fig.5 Cloning of coding sequence for CtPAL4 gene

3.4 CtPAL4 基因的生物信息學(xué)分析

將測序正確的CtPAL4基因序列進行生物信息學(xué)分析。序列分析表明，CtPAL4基因的開放閱讀框（ORF）為2124 bp，編碼707 個氨基酸（圖6-A），相對分子質(zhì)量為76 820，蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖6-B所示，與苯丙氨酸解氨酶X 射線蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)類似。用Conserved Domains Search（InterProScan）預(yù)測蛋白質(zhì)序列的功能結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示，CtPAL4基因具有典型的苯丙氨酸解氨酶基因的功能結(jié)構(gòu)域及活性位點（圖6-C）。基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用WOLF PSORT 在線分析軟件，對CtPAL4基因編碼蛋白進行亞細胞定位分析，推測其在細胞中的位置，結(jié)果顯示，其可能定位在葉綠體和細胞質(zhì)中，與PAL 定位于細胞質(zhì)和一些細胞器（葉綠體、線粒體、過氧化酶體）相吻合。

圖6 CtPAL4 基因編碼氨基酸組成及蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Amino acids and protein structure of CtPAL4 gene

3.5 CtPAL4 基因的系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN 軟件將CtPAL4基因與其他物種的基因進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析。利用clustalW1.83軟件進行多重序列比對、聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果顯示，CtPAL4基因與擬南芥（AY303130.1）的PAL基因聚在相同的分支，說明從進化上看，紅花CtPAL4和擬南芥PAL 基因親緣關(guān)系最近（圖7）。

圖7 CtPAL4 基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.7 Analysis of evolutionary of CtPAL4 gene and others

3.6 CtPAL4 基因的植物表達載體構(gòu)建

將前期驗證成功的CtPAL4基因，在其引物兩端引入BglII 和BstE II，進行PCR 擴增，獲得帶有含BglII 和BstE II 雙酶切位點的CtPAL4基因，將其連接T 載體后命名為pEASY-T1-CtPAL4。將植物表達載體 pCAMBIA3301 和pEASY-T1-CtPAL4分別用BglII 和BstE II 進行雙酶切，目的片段與酶切后的pCAMBIA3301 載體用T4-DNA 連接酶連接后，得到植物表達載體pCAMBIA3301-CtPAL4。將構(gòu)建好的植物表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對重組陽性質(zhì)粒進行菌液PCR 驗證（圖8-A）和雙酶切驗證（圖8-B），都獲得預(yù)期大小為2124 bp 的目的片段，測序結(jié)果與預(yù)期相符，證明植物表達載體構(gòu)建成功。將酶切測序正確的植物表達載體pCAMBIA3301-CtPAL4質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，轉(zhuǎn)化后涂板，對挑取的9 個單菌落進行農(nóng)桿菌菌液PCR 鑒定（圖8-C），其中有2條非常亮的目的條帶出現(xiàn)，說明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功，可以用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖8 CtPAL4 基因植物表達載體構(gòu)建Fig.8 Construction of plant expression vector of CtPAL4

3.7 紅花懸浮細胞遺傳體系的建立

對紅花種子暗培養(yǎng)而成的無菌苗子葉進行愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，獲得質(zhì)地疏松、不透明且黃綠色的愈傷組織，作為遺傳轉(zhuǎn)化受體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)、pBaster 篩選和繼代培養(yǎng)后獲得轉(zhuǎn)基因紅花愈傷組織。獲得的愈傷組織經(jīng)過液體培養(yǎng)，形成均一的轉(zhuǎn)基因紅花懸浮細胞。

結(jié)果表明，當(dāng)真空壓力超過20 kPa 時，愈傷組織細胞容易發(fā)生破碎；當(dāng)重懸液A600高于0.5 時，農(nóng)桿菌難以被抑制，愈傷組織生長緩慢易褐化；共培養(yǎng)時間可延長至4 d。實驗得出較優(yōu)的遺傳轉(zhuǎn)化條件組合：重懸液A600＝0.5、10 kPa、侵染15 min 并共培養(yǎng)4 d。

結(jié)果表明，在75 mg/L 羧芐、100 mg/L 頭孢和1.0 mg/L 草甘膦壓力下，起到了一定的篩選作用。未經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織幾乎全部褐化死亡，而遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織因為具有篩選標(biāo)記基因可以正常生長且長勢良好。

對轉(zhuǎn)GUS基因愈傷組織進行組織化學(xué)染色，如圖9 所示，顯微鏡下觀察GUS轉(zhuǎn)基因細胞為藍色，而非GUS轉(zhuǎn)基因則為棕綠色，說明外源基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到愈傷組織中。

圖9 轉(zhuǎn)基因愈傷組織GUS 染色驗證Fig.9 GUS staining of transgenic callus

同時，將愈傷組織置于液體培養(yǎng)基中，避光搖床25 ℃、100 r/min 培養(yǎng)7 d，濾出愈傷組織，濾紙吸干表面水分。將細胞培養(yǎng)物置于60 ℃烘箱中烘3 h，計算細胞增長率為190.7%。

3.8 轉(zhuǎn)CtPAL4 基因懸浮細胞的分子鑒定

經(jīng)過壓力篩選去除掉未經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織，遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織形成的轉(zhuǎn)CtPAL4基因懸浮細胞，繼代培養(yǎng)3 次后，提取轉(zhuǎn)基因愈傷組織的基因組DNA，利用PAL 特異引物CtPAL4r 和CtPAL4f 進行PCR 鑒定。電泳結(jié)果如圖10 所示，目的基因條帶與CtPAL4基因大小一致，為2124 bp。因此，說明CtPAL4基因初步在紅花懸浮細胞中實現(xiàn)過表達。

圖10 轉(zhuǎn)CtPAL4 基因懸浮細胞的分子鑒定Fig.10 Molecular identification of transgenic callus

4 討論

PAL（EC 4.3.1.5）通常是由小的多基因家族編碼[12]，在不同的植物物種中，PAL 基因家族的數(shù)量差異很大，從2 個到12 個不等，甚至達到40～50個[34]。在大多數(shù)高等植物中，PAL 是由2～6 個基因家族構(gòu)成的小基因家族編碼的[35]。通過對紅花PAL基因家族進行生物信息學(xué)分析，在紅花基因組中共檢索到6 個含有PAL 特有結(jié)構(gòu)域的紅花PAL家族基因，說明紅花有6 個PAL基因家族成員，與其他大多數(shù)植物PAL基因家族成員個數(shù)相似，基本不含冗雜和未被利用的PAL。PAL 為同源四聚體，每個單體含有1 個MIO 結(jié)構(gòu)域。MIO 結(jié)構(gòu)域是PAL酶催化的輔因子，MIO 結(jié)構(gòu)域含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）和三聯(lián)體活性中心（Ala-Ser-Gly）[36]。MIO 結(jié)構(gòu)域三聯(lián)體活性中心作為輔酶增強PAL 活性，通過攻擊苯丙氨酸的芳香環(huán)，而增加苯丙氨酸的親電性，來實現(xiàn)催化苯丙氨酸生成肉桂酸[37]，紅花中的CtPAL1～5基因家族成員均含有MIO 結(jié)構(gòu)域，均可以催化苯丙氨酸生成肉桂酸。CtPAL6不具有MIO 結(jié)構(gòu)域，在紅花中可能行使不同的生理功能，也可能屬于冗雜或未被利用的PAL。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種植物物種，目前，番茄、甜椒、馬鈴薯、油桐、煙草和橡膠樹等多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化日趨完善[38-40]。但是，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅花愈傷組織CtPAL4基因遺傳轉(zhuǎn)化研究尚少，尚未建立一個有效完整的方案。本研究應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，成功將紅花黃酮代謝中關(guān)鍵酶PAL基因轉(zhuǎn)化入紅花愈傷組織，并形成紅花懸浮細胞。紅花種子暗培養(yǎng)而成的無菌苗子葉外植體，誘導(dǎo)形成的愈傷組織對農(nóng)桿菌侵染有敏感性，且耐侵染、抑菌性強、恢復(fù)力強，符合作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體條件[41]，紅花種子經(jīng)過5 d 的種子萌發(fā)、12 d 的植物激素（萘乙酸和6-芐基氨基喋呤）誘導(dǎo)愈傷和愈傷繼代培養(yǎng)，獲得質(zhì)地疏松、不透明且黃綠色的愈傷組織，可以作為根瘤農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的受體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化需要經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)、pBaster篩選和繼代培養(yǎng)，才能獲得轉(zhuǎn)基因紅花愈傷組織。目前的研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅花遺傳轉(zhuǎn)化效率取決于紅花的基因型、苗齡、共培養(yǎng)時間、細菌細胞密度、AS 濃度和外植體類型等多種因素[33]。本實驗建立的遺傳轉(zhuǎn)化方案較優(yōu)，轉(zhuǎn)化效率較高。

PAL 是目前研究最廣泛的植物次生代謝酶之一。PAL 因其在植物發(fā)育中的作用，對植物類苯基丙烷次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控，對多種環(huán)境刺激的響應(yīng)而被廣泛研究。PAL 催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，是紅花黃酮類生物合成途徑的起始反應(yīng)，其表達水平與木脂素、黃酮類、香豆素和植物抗毒素的合成和積累密切相關(guān)[42-44]。PAL 又是一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)植物在受到病原體攻擊、機械損傷、紫外線照射、鹽分脅迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)PAL 編碼基因的表達[12-14,16]。本研究通過生物信息學(xué)分析紅花PAL 基因家族啟動子上游順式作用元件，發(fā)現(xiàn)紅花具有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、防御及脅迫響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和類黃酮合成相關(guān)的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等順式作用元件?？梢姰?dāng)紅花受到環(huán)境刺激，相應(yīng)的順式作用元件在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控[45]，從而影響PAL 的轉(zhuǎn)錄表達。

轉(zhuǎn)基因懸浮細胞培養(yǎng)被應(yīng)用于細胞和分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究（如功能基因的研究）和合成生物學(xué)方面（如藥用蛋白的生產(chǎn)）。在這2 種情況下，外源基因或內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定整合都是必需的技術(shù)[46]。目前，王立勇等[19]實現(xiàn)人源CD20 片段抗體在紅花懸浮細胞中的外源基因表達；劉金娜等[47]實現(xiàn)番茄Bax inhibitor-1 基因在煙草懸浮細胞中的外源基因表達；在研究雷公藤、綠竹、甘草等植物生長代謝相關(guān)基因功能時，懸浮細胞同源基因的轉(zhuǎn)化與表達也得以實現(xiàn)[25-26,28-29,46]。本研究轉(zhuǎn)CtPAL4基因紅花懸浮細胞在經(jīng)過3 次繼代培養(yǎng)后，PCR 鑒定仍有目的基因出現(xiàn)，說明CtPAL4基因已經(jīng)初步在紅花懸浮細胞中實現(xiàn)過表達，為后續(xù)利用轉(zhuǎn)基因紅花懸浮細胞鑒定外源基因提供理論依據(jù)。為研究CtPAL4等合成代謝關(guān)鍵酶基因在次生代謝產(chǎn)物中的功能和作用、紅花懸浮細胞產(chǎn)業(yè)化生物合成黃酮類次生代謝產(chǎn)物，奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突