龔普陽，潘燁華，郭瑜婕，哈立洋，李曉朋，顧 健*

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430000

竹葉椒為蕓香科植物竹葉椒Zanthoxylum armatumDC.的果實(shí)，具有溫中燥濕、散寒止痛的功效，用于治療脘腹冷痛、寒濕吐瀉、蛔厥腹痛、齲齒牙痛等癥[1-2]。以其生藥材為主要原料制備而成的竹葉椒片臨床常用于治療急性闌尾炎、腹痛及胃痛，療效顯著[3]。竹葉椒傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代臨床研究均表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。揮發(fā)油是竹葉椒的主要活性組分之一，包含烯烴、烷烴、醇類、酯類等多種成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹葉椒揮發(fā)油能夠顯著抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、環(huán)氧合酶 2（cyclooxygenase-2，COX-2）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達(dá)[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物信息學(xué)研究的重要工具，利用網(wǎng)絡(luò)可視化方法分析疾病與藥物及靶點(diǎn)間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，具有整體性和系統(tǒng)性特點(diǎn)，目前已廣泛用于預(yù)測中藥調(diào)控機(jī)體生物網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制[5]。本研究整合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析與生物信息學(xué)技術(shù)，探究竹葉椒揮發(fā)油主要活性成分的作用靶點(diǎn)及信號通路，預(yù)測竹葉椒揮發(fā)油多成分、多層次、多途徑的抗炎、鎮(zhèn)痛潛在作用機(jī)制，為竹葉椒藥用價(jià)值的深入研究與臨床合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

竹葉椒購自四川省洪雅縣，經(jīng)西南民族大學(xué)藥學(xué)院顧健教授鑒定為蕓香科花椒屬植物竹葉椒Z.armatumDC.的果實(shí)。

1.2 試劑

無水硫酸鈉（批號20200612）購自天津福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

QP2010 Ultra GC-MS 儀（日本Shimadzu 公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（浙江力凡儀器科技有限公司）；JA2003 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 竹葉椒揮發(fā)油的GC-MS 分析

2.1.1 竹葉椒揮發(fā)油的制備 采用水蒸氣蒸餾法提取竹葉椒揮發(fā)油，無水硫酸鈉脫水，精密吸取1 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，得到供GC-MS 分析的揮發(fā)油樣品。

2.1.2 氣相色譜條件 DB-130 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流比為150∶1；壓力為48 kPa；柱箱溫度為50 ℃；進(jìn)樣溫度為300 ℃；吹掃體積流量為3.0 mL/min；色譜柱初始溫度為50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫至80 ℃，再以15 ℃/ min 升溫至300 ℃，保持20 min；進(jìn)樣量為2 μL；載氣為氦氣。

2.1.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度為230 ℃；接口溫度為300 ℃；溶劑延遲時(shí)間為2.00 min；每0.3 秒掃描采集數(shù)據(jù)，掃描速度為2000，掃描范圍為m/z30～550。

2.2 竹葉椒揮發(fā)油成分的潛在作用靶點(diǎn)收集

基于GC-MS 獲得的竹葉椒揮發(fā)油化學(xué)成分信息，采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）進(jìn)行成分查詢及靶點(diǎn)收集。對于TCMSP 未收錄的其他竹葉椒揮發(fā)油成分，借助PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）查詢成分相應(yīng)SMILES 號，進(jìn)一步采用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測補(bǔ)充[6]。

2.3 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在OMIM（http:// www.omim.org/）和GisGeNET（http://www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫中，以“炎性反應(yīng)”“疼痛”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)靶點(diǎn)，去除重復(fù)和假陽性靶點(diǎn)，構(gòu)建炎性反應(yīng)、疼痛靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集[7]。分別構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件將2 個(gè)網(wǎng)絡(luò)合并，去除無關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)，得到竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的活性成分及主要靶點(diǎn)，借助Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因簡稱。

2.4 靶點(diǎn)的組織分布網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入 BioGPS（http://biogps.org/#goto＝welcome）數(shù)據(jù)庫，獲得靶點(diǎn)與組織的對應(yīng)關(guān)系，并采用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-組織”網(wǎng)絡(luò)，以基因表達(dá)量為指標(biāo)篩選前10 個(gè)靶點(diǎn)主要分布的器官、組織或部位，獲得竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的組織分布[8]。

2.5 蛋白- 蛋白相互作用（ protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.3”項(xiàng)下獲得的主要靶點(diǎn)輸入STRING 在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設(shè)置“Homo sapiens”，獲得PPI 關(guān)系，結(jié)果保存為RTF 格式，將節(jié)點(diǎn)及結(jié)合作用評分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，篩選核心靶點(diǎn)[9]。

2.6 基因本體論（gene ontology，GO）功能與京都基因及基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將篩選得到的竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），設(shè)置“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 功能及KEGG通路富集分析[10-11]，采用Graphpad Prism 8 軟件及在線繪圖站Omishare（http://www.omicshare.com/ tools/index.php/）將結(jié)果可視化。

2.7 分子對接驗(yàn)證

通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型3（muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA）和大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CNR2）4 個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白的晶體復(fù)合物，借助Discovery Studio 軟件進(jìn)行蛋白修飾，去除其配體與非蛋白分子，以pdb 格式保存，采用Open Bable GUI 軟件轉(zhuǎn)為pdbqt 格式。借助PubChem 在線數(shù)據(jù)庫獲取主要活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，采用Sybyl 軟件對各成分進(jìn)行能量優(yōu)化。利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，以結(jié)合能評價(jià)竹葉椒揮發(fā)油潛在活性成分與4 個(gè)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力[12]。

3 結(jié)果

3.1 竹葉椒揮發(fā)油化學(xué)成分的定性表征

采用GC-MS 法測定竹葉花椒揮發(fā)油中的化學(xué)成分，總離子流見圖1。通過氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST08.LIB 數(shù)據(jù)匹配，結(jié)合文獻(xiàn)資料解析，鑒定出竹葉椒揮發(fā)油化學(xué)成分44 個(gè)，其中烯烴類成分23個(gè)、醇類成分7 個(gè)、酯類成分2 個(gè)、苯及其衍生物1 個(gè)、其他類型及未知成分11 個(gè)。如表1 所示，芳樟醇占比最高，為29.78%；檸檬烯占比為15.35%，β-月桂烯占比為14.42%。

圖1 竹葉椒揮發(fā)油的GC-MS 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of GC-MS of volatile oil of Z.armatum

3.2 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

如圖2 所示，“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)有114 個(gè)節(jié)點(diǎn)、269 條邊，平均度值為4.3，節(jié)點(diǎn)顏色越深、面積越大代表度值越高。圓形節(jié)點(diǎn)為竹葉椒揮發(fā)油活性成分共38 個(gè)，其中ZA42、ZA31、ZA38、ZA33、ZA43、ZA9、ZA23 和ZA39 度值均≥5，度值≥2 的成分占總成分的73.68%；未預(yù)測到ZA8、ZA3、ZA15和ZA37 抗炎、鎮(zhèn)痛的作用靶點(diǎn)，因此予以剔除。菱形節(jié)點(diǎn)為交集靶點(diǎn)共78 個(gè)，度值均≥2，其中PTGS2、CHRM3、PPARA、CNR2、腎上腺素能受體α1A（adrenergic receptor α1A，ADRA1A）、F10、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)γ1（immunoglobulin heavy constant γ1，IGHG1）和非受體型酪氨酸蛋白磷酸酶 1（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）節(jié)點(diǎn)度值均≥5，度值≥3 的靶點(diǎn)占總靶點(diǎn)的51.28%。

表1 竹葉椒揮發(fā)油中化學(xué)成分的定性分析Table 1 Qualitative analysis of chemical composition in volatile oil of Z.armatum

3.3 靶點(diǎn)與組織分布關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

如圖3 所示，靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)包含126 個(gè)節(jié)點(diǎn)、782 條邊，平均度值為9.63，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在作用靶點(diǎn)，長方形節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)靶點(diǎn)可能分布的組織或器官，邊代表靶點(diǎn)與組織之間的相互作用關(guān)系。44 個(gè)靶點(diǎn)分布于淋巴組織，43 個(gè)靶點(diǎn)分布于肝臟，41 個(gè)靶點(diǎn)分布于心肌細(xì)胞，37 個(gè)靶點(diǎn)分布于心臟。此外，CD33、CD34、CD14、CD56 等靶點(diǎn)分布于抗原蛋白。因此，竹葉椒揮發(fā)油可能通過作用于多種組織或器官的靶點(diǎn)，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用，且免疫調(diào)控可能是其主要作用機(jī)制之一。

圖2 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Ingredient-target-disease” network of volatile oil of Z.armatum on anti-inflammation and analgesic

圖3 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)的組織分布網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Potential targets-tissue distribution network of volatile oil of Z.armatum on anti-inflammation and analgesic

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

如圖4 所示，PPI 網(wǎng)絡(luò)共有75 個(gè)節(jié)點(diǎn)、519 條邊，平均度值為13.8。PCYT1A、SIGMAR1、IGHG1未參與PPI，因此予以剔除。度值≥3 的靶點(diǎn)占總靶點(diǎn)的93.33%，度值＞20 的靶點(diǎn)主要包含PTGS2、IL6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、NOS3、β-淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、IL1B 等。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，篩選出大于平均度值的靶點(diǎn)33 個(gè)見圖5，提示這些靶點(diǎn)可能在竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用。

圖4 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of volatile oil of Z.armatum on anti-inflammation and analgesic

圖5 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛核心靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系Fig.5 Key targets interaction of volatile oil of Z.armatumon anti-inflammation and analgesic

3.5 GO 功能分析

借助DAVID 數(shù)據(jù)庫對篩選得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，即從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3 個(gè)方面進(jìn)行基因功能注釋。共獲得130 個(gè)GO條目（P＜0.01），其中85 個(gè)涉及生物過程、16 個(gè)涉及細(xì)胞組分、29 個(gè)涉及分子功能。以基因數(shù)進(jìn)行降序排列，各選取前15 個(gè)條目，如圖6 所示，生物過程結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的靶點(diǎn)主要與RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原進(jìn)程、炎性反應(yīng)等有關(guān)；分子功能結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛作用主要與酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、同蛋白結(jié)合、受體結(jié)合及序列特異性DNA 結(jié)合等方面相關(guān)；細(xì)胞組分結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油可能作用于質(zhì)膜、膜的整體組成、質(zhì)膜的組成部分、胞外區(qū)、細(xì)胞外空間等，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

圖6 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)的GO 富集分析 (前15)Fig.6 GO enrichment analysis of potential anti-inflammation and analgesic targets of volatile oil of Z.armatum(top 15)

3.6 KEGG 靶點(diǎn)通路富集分析

共篩選得到60 條信號通路，選取P值較小的20 條信號通路進(jìn)行可視化，如圖7 所示，竹葉椒揮發(fā)油的抗炎、鎮(zhèn)痛機(jī)制主要與神經(jīng)活性配體受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、胰島素抵抗（insulin resistance）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、鈣信號通道（calcium signaling pathway）、磷酯酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路相關(guān)。

圖7 竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)KEGG 富集分析的20 條通路Fig.7 KEGG enrichment analysis of 20 pathways of potential anti-inflammation and analgesic targets of volatile oil of Z.armatum

3.7 竹葉椒揮發(fā)油中主要活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對接

為進(jìn)一步驗(yàn)證竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛核心靶點(diǎn)與活性成分間的相互作用，篩選“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中12 個(gè)活性成分（中心度值＞3）及2 種臨床藥物（阿司匹林、塞來昔布）與4 個(gè)核心靶點(diǎn)（PTGS2、CHRM3、PPARA、CNR2）進(jìn)行分子對 接分析，結(jié)果如表2 所示，結(jié)合能越小，表明配體與蛋白間的親和力越高，結(jié)合能＜-5.0 kJ/moL 表明活性成分與靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的親和活性。12 個(gè)活性成分與4 個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均＜-6.5 kJ/moL，表明竹葉椒揮發(fā)油活性成分與4 個(gè)核心靶點(diǎn)均有較好的親和能力，其中ZA43、ZA28 與PTGS2、CHRM3、PPARA 和CNR2 的結(jié)合能均＜-10.0 kJ/mol，且結(jié)合體構(gòu)象較穩(wěn)定，分子對接模式見圖8。

表2 竹葉椒揮發(fā)油主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 2 Binding affinities of active ingredients of volatile oil of Z.armatum with core targets

圖8 ZA28、ZA43 與4 個(gè)核心靶點(diǎn)的分子對接Fig.8 Molecular docking of ZA28 and ZA43 with four core targets

4 討論

竹葉椒又名山花椒、狗椒、野花椒等，始載于《本草圖經(jīng)》，是我國花椒種質(zhì)資源的特色品種，主要分布于我國西南各省[13]。竹葉椒在四川產(chǎn)量極為豐富，常用于治療風(fēng)濕、疼痛及跌打損傷等[14]。為深入挖掘竹葉椒的藥用資源價(jià)值，本研究基于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，應(yīng)用生物網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)合分子對接預(yù)測竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的“成分-靶點(diǎn)”相互作用，進(jìn)而探索其潛在的作用機(jī)制。基于GC-MS 的化學(xué)物質(zhì)組研究定性鑒別竹葉椒揮發(fā)油中44 個(gè)化學(xué)成分，其中芳樟醇、檸檬烯和β-月桂烯占比較高，占比均＞14%，與已報(bào)道的四川產(chǎn)竹葉椒揮發(fā)油組分表征結(jié)果一致[15]。然而，相關(guān)研究表明浙江產(chǎn)竹葉椒中以桉葉油醇和α-松油醇占比較高，分別為37.96%、17.62%；湖北產(chǎn)竹葉椒則以桉葉油醇和萜品烯占比較高，占比分別為36.19%、21.31%[13,16]。由此可見，與浙江和湖北等產(chǎn)地的竹葉椒相比，本研究所采用的四川產(chǎn)竹葉椒在揮發(fā)油組分的化學(xué)組成和主要成分含量上可能存在較大差別。因此，可進(jìn)一步基于揮發(fā)油特征成分的“質(zhì)-量”進(jìn)行不同產(chǎn)地的竹葉椒質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的篩選，從而為該藥材產(chǎn)地的精準(zhǔn)溯源和有效鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

四川產(chǎn)竹葉椒揮發(fā)油中主要成分芳樟醇在醋酸、谷氨酸誘導(dǎo)的多種疼痛動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出顯著鎮(zhèn)痛作用[17-18]；檸檬烯對潰瘍性結(jié)腸炎和呼吸系統(tǒng)炎癥損傷均具有改善作用[19-20]；月桂烯對熱板、福爾馬林、坐骨神經(jīng)壓迫刺激誘導(dǎo)的小鼠疼痛均有明顯抑制作用[21-22]；芝麻素可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠足巨噬細(xì)胞中一氧化氮（nitric oxide，NO）、TNF-α、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的表達(dá)和釋放[23]，提示竹葉椒揮發(fā)油可能通過多種成分協(xié)同發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

為進(jìn)一步探討竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)篩選其可能的作用靶點(diǎn)蛋白群，并對相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行組織分布、PPI、GO 功能富集及KEGG 通路富集分析。組織分布結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油所對應(yīng)的78 個(gè)靶點(diǎn)主要富集于淋巴組織、肝臟、心肌細(xì)胞和心臟，為其針對特定組織或器官的抗炎、鎮(zhèn)痛作用提供了一定依據(jù)。富集結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛相關(guān)的通路主要涉及神經(jīng)活性配體受體相互作用、5-羥色胺能突觸、花生四烯酸代謝及PI3K/Akt 信號通路等，并涉及RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、酶結(jié)合、質(zhì)膜等多種生物學(xué)過程。

綜合“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)與PPI 分析結(jié)果，篩選得到PTGS2（對應(yīng)21 個(gè)成分）、CHRM3（對應(yīng)9 個(gè)成分）、PPARA（對應(yīng)6 個(gè)成分）和CNR2為竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的潛在核心靶點(diǎn)。PTGS2是一種PTGS 的誘導(dǎo)型同工酶（COX-2），COX-2是抑制前列腺素介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和疼痛的經(jīng)典藥物靶點(diǎn)。CHRM3 為毒蕈堿型乙酰膽堿受體，在胰腺炎、膽管炎、呼吸道炎性反應(yīng)等疾病發(fā)生中具有重要作用[24-26]。通過M3-乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑介導(dǎo)的CHRM3 受體的激活可能會(huì)促進(jìn)IL-8 表達(dá)，調(diào)節(jié)CHRM3 表達(dá)可以作為一種潛在治療炎性疾病的方法[27]。PPARA 主要參與脂肪酸及其衍生物的氧化代謝，PPARA 激動(dòng)劑能夠有效抑制多種炎性反應(yīng)[28-30]。在LPS 刺激的人單核細(xì)胞中，PPARA的激活能夠通過調(diào)節(jié)活化因子蛋白-1（activator protein-1，AP1）和NF-κB 信號通路，從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、組織因子（tissue factor，TF）等多種促炎分子的產(chǎn)生；小鼠巨噬細(xì)胞中PPARA 缺乏后，其抗炎作用減弱，提示PPARA 參與炎性反應(yīng)的調(diào)控[31]。CNR2 作為一種G 蛋白偶聯(lián)受體，為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成部分，與疼痛感知、炎性反應(yīng)密切相關(guān)[32]。CNR2 激動(dòng)劑可改善結(jié)腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化及缺血再灌注損傷中的炎性反應(yīng)，并能夠有效減輕癌癥誘發(fā)的骨疼痛[33-34]。分子對接結(jié)果顯示，竹葉椒揮發(fā)油中主要活性成分與4 個(gè)核心靶點(diǎn)均具有較好的親和力，驗(yàn)證了采用網(wǎng)絡(luò)分析所篩選的PTGS2、CHRM3、PPARA 和CNR2 4 個(gè)核心靶點(diǎn)的可靠性。(-)-β-花柏烯、膽甾烯基豆蔻酸酯、芝麻素及β-欖香烯等微量成分與4 個(gè)核心靶點(diǎn)的親和能力較強(qiáng)，結(jié)合能均＜-8.0 kJ/moL；芝麻素與4 個(gè)核心靶點(diǎn)的親和力均優(yōu)于陽性藥物阿司匹林和塞來昔布，表明竹葉椒揮發(fā)油中除含量較高的芳樟醇等成分以外，多種微量成分仍可能通過多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用。因此，可進(jìn)一步結(jié)合親和超濾及配體垂釣等實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證以上活性成分與靶點(diǎn)的親和作用及相關(guān)生物學(xué)活性。

綜上所述，本研究基于GC-MS 技術(shù)定性表征竹葉椒揮發(fā)油的化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接篩選并驗(yàn)證其主要活性成分的作用靶點(diǎn)，初步探討了竹葉椒揮發(fā)油抗炎、鎮(zhèn)痛的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明竹葉椒的抗炎、鎮(zhèn)痛機(jī)制提供了一定的研究方向和數(shù)據(jù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突