牧亞峰，向 楠, ，左新河, ，余欣然，趙 勇，陳繼東,

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061

2.湖北省中醫(yī)院 甲狀腺疾病診療中心，湖北 武漢 430074

3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）又稱橋本甲狀腺炎，是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病。隨著病情進展，20%～30%患者最終發(fā)展為甲狀腺功能減退癥，表現(xiàn)為畏寒、心動過緩、便秘、黏液性水腫等典型癥狀及體征[1]。AIT 的病因與發(fā)病機制尚未完全闡明，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為其發(fā)病是遺傳、環(huán)境、免疫等多因素共同作用的結(jié)果[2]。腸道是人體重要的消化及免疫器官，AIT 患者腸道菌群物種組成發(fā)生改變且多樣性增加[3-4]。腸黏膜屏障作為機體第一道防線，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。自身免疫性肝炎、糖尿病、炎癥性腸病、慢性腎臟病等自身免疫性疾病均存在腸黏膜屏障損傷，損傷原因涉及細胞因子、腸道菌群、腸道免疫功能等多個方面[5]。研究發(fā)現(xiàn)AIT 患者的十二指腸遠端腸上皮細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生變化[6]。腸道菌群與腸黏膜屏障相互作用，共同維持著腸道穩(wěn)態(tài)，一旦兩者之間平衡被打破，可能誘發(fā)自身免疫性疾病[7]。

白芍總苷是白芍PaeonialactifloraPall.的主要有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保護血管、護肝、調(diào)節(jié)免疫、抗抑郁、改善學(xué)習(xí)記憶等作用，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、白塞病、過敏性紫癜、變應(yīng)性鼻炎、強直性脊柱炎等自身免疫性疾病[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能夠降低AIT 大鼠甲狀腺自身抗體水平，減輕甲狀腺組織炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg），從而起到治療AIT 的作用[9-10]。本研究探討白芍總苷對AIT 大鼠腸道菌群及腸黏膜屏障的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雌性SD 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量（110±10）g，購自三峽大學(xué)，動物許可證號SCXK（鄂）2017-0012。動物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度（23±2）℃、相對濕度（55±10）%、光照12 h/d，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號 HUCMS 201909008）。

1.2 藥品與試劑

白芍總苷膠囊（規(guī)格0.3 g/粒，每克含芍藥苷347 mg，批號H20055058）購自寧波立華制藥有限公司；硒酵母片（規(guī)格50 μg/片，批號H10940161）購自牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司；豬甲狀腺球蛋白（批號180801）、完全弗氏佐劑（批號F5881）、不完全弗氏佐劑（批號F5506）購自美國Sigma 公司；甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibodies，TPOAb）ELISA 試劑盒（批號E11199r）購自武漢華美生物工程有限公司；甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibodies，TGAb）ELISA 試劑盒（批號R0551）購自南京森貝伽生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）ELISA試劑盒（批號分別為R2856c、R0016c、R0875c）購自武漢伊萊瑞特生物公司；閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）抗體（批號A0659）購自Abclonal 公司；閉合蛋白（Occludin）抗體（批號13409-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；β-actin 抗體（批號BM0627）、山羊抗小鼠二抗（批號BA1051）、山羊抗兔二抗（批號BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司；DNA 提取試劑盒購自美國 Omega 公司；TransStart Fastpfu DNA Polymerase 購自北京TransGen 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自美國Axygen 公司。

1.3 儀器

H1650-W 離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；Flexstation3 多功能酶標(biāo)儀（美國MD 公司）；RM2016 輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica 公司）；DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；HT7700-SS 透射電鏡（TEM，日本HITACHI 公司）；NanoDrop2000 分光光度計（美國賽默飛公司）；QuantStudio6 PCR 儀（美國ABI公司）；Miseq PE300 測序儀（美國Illumina 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機選取8 只作為對照組，其余大鼠采用豬甲狀腺球蛋白與弗氏佐劑免疫注射聯(lián)合高碘水喂養(yǎng)制備AIT 大鼠模型[11]。第2～7 周大鼠sc 100 μg 豬甲狀腺球蛋白，1 次/周，進行2 次初次免疫和4 次加強免疫，同時給予碘化鈉水（0.64 g/L）喂養(yǎng)，建立AIT 模型。造模大鼠隨機分為模型組、硒酵母（36 μg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組及白芍總苷低、中、高劑量（160、320、640 mg/kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2、4 倍）組，每組8 只[12]。硒酵母片研磨至極細粉末，溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為3.6 μg/mL 的混懸液；白芍總苷膠囊溶于生理鹽水，分別配制成質(zhì)量濃度為16、32、64 mg/mL 的溶液。自第7 周開始，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/周，連續(xù)6 周。

2.2 白芍總苷對AIT 大鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α 和IL-10 水平的影響

給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 10%水合氯醛麻醉后取血，離心取血清，按試劑盒說明書測定血清中TGAb、TPOAb、TNF-α 和IL-10 水平。

2.3 白芍總苷對AIT 大鼠甲狀腺和結(jié)腸病理變化的影響

大鼠取血完畢后，快速分離甲狀腺和結(jié)腸組織，以生理鹽水清洗，切成厚度為0.2～0.3 cm 的組織塊，于4%多聚甲醛中固定24～48 h，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋并制成厚度為4 μm 的切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響

取各組結(jié)腸組織，于2.5%戊二醛中固定，用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗，于1%鋨酸室溫固定2 h，常規(guī)梯度酒精脫水，丙酮滲透，環(huán)氧樹脂包埋，60～80 nm 超薄切片，進行鈾鉛雙染色，于TEM 下觀察結(jié)腸組織緊密連接、上皮微絨毛等超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.5 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸組織sIgA 水平的影響

取各組結(jié)腸組織，剪碎后用勻漿機制備勻漿液，3000 r/min 離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測定結(jié)腸組織中sIgA 水平。

2.6 白芍總苷對 AIT 大鼠結(jié)腸組織 ZO-1 和Occludin 蛋白表達的影響

取各組結(jié)腸組織，剪碎后加入磷酸酶抑制劑，裂解后勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于脫脂牛奶中封閉2 h，加入ZO-1 和Occludin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌，加入山羊抗小鼠/兔二抗（1∶50 000），37 ℃孵育2 h；加入ECL 發(fā)光液顯影曝光，掃描膠片，采用BandScan 軟件分析。

2.7 糞便菌群DNA 的提取及測序

每組隨機選取5 只大鼠，肛周消毒后固定并將其尾部提起，手指按壓下腹部促使排便，收集糞便2～3 顆于滅菌凍存管。按試劑盒說明書進行微生物群落總DNA 抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測定DNA 質(zhì)量濃度和純度。 使用擴增引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（ 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’ ） 對 16S rRNA V3～4 可變區(qū)進行PCR 擴增，擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，4 ℃保存。擴增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠回收，利用DNA 凝膠試劑盒對回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 建庫，利用MiSeq PE300 平臺進行高通量測序。利用生物信息學(xué)方法進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類（物種注釋及豐度分析）、物種多樣性、物種分類學(xué)組成等分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后多重比較用LSD 法。

3 結(jié)果

3.1 白芍總苷對AIT 大鼠血清中TGAb、TPOAb、TNF-α 和IL-10 水平的影響

如圖1 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TGAb、TPOAb 和TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.001），IL-10 水平明顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TGAb、TPOAb、TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.001），IL-10 水平均顯著升高（P＜0.001）。

圖1 白芍總苷對AIT 大鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α 和IL-10 水平的影響 ( ± s , n=8)Fig.1 Effect of total glucosides of P. lactiflora on TGAb, TPOAb, TNF-α and IL-10 levels in serum of AIT rats ( ± s , n=8)

3.2 白芍總苷對AIT 大鼠甲狀腺和結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖2 所示，對照組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，呈類圓形，濾泡上皮細胞呈單層立方形，排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡間隙未見淋巴細胞浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞呈扁平狀，大部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞萎縮，可見淋巴細胞浸潤；硒酵母組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞排列整齊，濾泡腔萎縮，膠質(zhì)含量減少，可見吸收空泡；白芍總苷各劑量組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整性改善，淋巴細胞浸潤明顯減少，病變程度有所減輕。

圖2 白芍總苷對AIT 大鼠甲狀腺 (A) 和結(jié)腸組織 (B) 病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.2 Effect of total glucosides of P. lactiflora on pathological changes of thyroid tissues and colon tissues in AIT rats (HE, × 100)

對照組大鼠結(jié)腸黏膜完整，上皮細胞排列整齊，黏膜隱窩平行排列，杯狀細胞豐富，無淋巴細胞浸潤；模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮部分?jǐn)嗔?、不完整，黏膜隱窩形態(tài)扭曲，伴有淋巴細胞浸潤；各給藥組結(jié)腸黏膜完整性有所恢復(fù)，淋巴細胞浸潤明顯減少。

3.3 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖3 所示，對照組大鼠結(jié)腸黏膜細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整，連接致密、連續(xù)，橋粒密度較高，上皮細胞表面微絨毛正常；模型組結(jié)腸黏膜細胞間緊密連接出現(xiàn)部分?jǐn)嗔?，連接開放、疏松，橋粒密度下降，微絨毛數(shù)量減少，且排列較紊亂；各給藥組結(jié)腸黏膜細胞間緊密連接的連續(xù)性均有不同程度恢復(fù)，連接更加緊密，腸上皮微絨毛數(shù)量增加，排列較模型組整齊。

圖3 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響 (×12 000)Fig.3 Effect of total glucosides of P. lactiflora on tight junction structure of colonic mucosa in AIT rats (× 12 000)

3.4 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸組織中sIgA 水平的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中sIgA 水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織sIgA 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖4 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸組織sIgA 水平的影響 ( ± s , n=8)Fig.4 Effect of total glucosides of P. lactiflora on sIgA level in colon tissues of AIT rats ( ± s , n=8)

3.5 白芍總苷對 AIT 大鼠結(jié)腸組織 ZO-1 和Occludin 蛋白表達的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平均顯著降低 （P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01、0.001）。

圖5 白芍總苷對AIT 大鼠結(jié)腸ZO-1 和Occludin 蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.5 Effect of total glucosides of P. lactiflora on expressions of ZO-1 and Occludin in colon tissues of AIT rats ( ± s , n=3)

3.6 白芍總苷對AIT 大鼠腸道菌群的影響

3.6.1 物種多樣性分析 本研究對大鼠糞便樣品進行測序及分析后，共得到798 330 條有效序列。如圖6 所示，當(dāng)Shannon 指數(shù)達到3.5 時，各樣本稀釋曲線趨向平坦，表明測序數(shù)據(jù)足夠大，能夠反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。α 多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性，如表1 所示，與對照組相比，模型組大鼠腸道菌群OTUs、Shannon、Simpson、Chao 和Ace 指數(shù)均呈上升趨勢；與模型組比較，硒酵母組大鼠腸道菌群OTUs、Shannon、Chao 和Ace 指數(shù)均呈升高趨勢，白芍總苷中、高劑量組大鼠腸道菌群OTUs、Chao 和Ace 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05、0.001）。表明AIT 大鼠腸道菌群物種多樣性增加、豐度升高，腸道菌群過度生長，白芍總苷能夠降低大鼠腸道菌群多樣性。

圖6 各組大鼠腸道菌群稀釋曲線分析 ( ± s , n=5)Fig.6 Rarefaction curve analysis on intestinal flora of rats in each group ( ± s , n=5)

β 多樣性通過分析不同樣本的物種多樣性，探索不同組樣本微生物群落的差異性。主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）是β 多樣性具有代表性的一種非約束性數(shù)據(jù)降維分析方法，樣品間距離越近，表明物種組成結(jié)構(gòu)越相似。如圖7所示，對照組和模型組在PC1 水平上明顯分開，表 明AIT 大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較對照組有明顯改變；各給藥組在PC1 水平上明顯偏離模型組，表明各給藥組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

表1 各組大鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù) ( ± s , n=5)Table 1 Alpha diversity index of intestinal flora in rats of each group ( ± s , n=5)

表1 各組大鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù) ( ± s , n=5)Table 1 Alpha diversity index of intestinal flora in rats of each group ( ± s , n=5)

與模型組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001#P ＜0.05 ###P ＜0.001 vs model group

劑量 OTUs Shannon 指物數(shù)種 多樣Si性mp s on 指數(shù) Chao 指數(shù) 物 種豐度 Ace 指數(shù)— 669.0±46.3 4.62±0.26 0.027±0.008 819.4±56.6 812.0±50.組別 對照 2 模型 — 708.0±55.8 4.66±0.31 0.028±0.008 867.2±67.4 855.9±57.8 硒酵母 036 μg·kg-1 721.2±44.9 4.67±0.22 0.027±0.009 904.9±60.3 899.2±65.6 白芍總苷 160 mg·kg-1 653.0±49.0 4.67±0.22 0.026±0.007 796.9±45.8 818.3±43.9 320 mg·kg-1 609.0±37.2# 4.50±0.25 0.023±0.007 749.2±52.8# 745.9±49.5# 640 mg·kg-1 537.6±46.3### 4.32±0.23 0.020±0.003 677.2±44.5### 671.8±49.9###

圖7 各組大鼠腸道菌群PCoA 分析 ( ± s , n=5)Fig.7 PCoA analysis on intestinal flora of rats in each group ( ± s , n=5)

3.6.2 群落結(jié)構(gòu)組成分析 如圖8 所示，在門水平上，各組大鼠腸道菌群主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門等，對照組大鼠腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。與對照組相比，模型組厚壁菌門相對豐度顯著升高（P＜0.001），擬桿菌門相對豐度顯著降低（P＜0.001），厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B）顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組厚壁菌門相對豐度顯著降低（P＜0.001)，擬桿菌門相對豐度明顯升高（P＜0.001），F(xiàn)/B 顯著降低（P＜0.001）。

圖8 門水平具有顯著差異的腸道菌群相對豐度 ( ± s , n=5)Fig.8 Relative abundance of intestinal flora with significant differences at phylum level ( ± s , n=5)

如圖9 所示，在屬水平上，各組大鼠腸道菌群主要包括Muribaculaceae、毛螺菌屬Lachnospiraceae、瘤胃球菌屬Ruminococcaceae、擬桿菌屬Bacteroides、乳酸桿菌屬Lactobacillus、羅姆布茨菌屬Romboutsia、Turicibacter、普雷沃氏菌屬Prevotellaceae、克里斯滕森菌屬Christensenellaceae等，其中乳酸桿菌屬、普雷沃氏菌屬與羅姆布茨菌屬組間變化明顯。與對照組相比，模型組乳酸桿菌屬、普雷沃氏菌屬和羅姆布茨菌屬相對豐度顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，硒酵母組及白芍總苷低、高劑量組乳酸桿菌屬、普雷沃氏菌屬和羅姆布茨菌屬相對豐度均明顯增加（P＜0.05、0.001），白芍總苷中劑量組羅姆布茨菌屬相對豐度顯著升高（P＜0.001）。

4 討論

本研究采用高碘水喂養(yǎng)聯(lián)合異原性抗原免疫法復(fù)制AIT 大鼠模型，模型組大鼠血清TGAb 和TPOAb 水平顯著升高，且甲狀腺組織濾泡結(jié)構(gòu)破壞，表明造模成功。補硒治療可以有效降低血清TPOAb 水平，由于硒酵母安全性高、臨床使用范圍廣，本研究將其作為陽性對照藥物[9]。結(jié)果顯示，白芍總苷顯著降低AIT 大鼠血清TGAb 和TPOAb水平，改善甲狀腺組織病理形態(tài)，與前期研究結(jié)果基本一致[9]；白芍總苷顯著降低血清中促炎細胞因子TNF-α 水平，升高抗炎細胞因子IL-10 水平，糾正炎性反應(yīng)穩(wěn)態(tài)失衡；白芍總苷能夠調(diào)節(jié)AIT 大鼠腸道菌群組成，升高結(jié)腸組織 sIgA、ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平，改善結(jié)腸黏膜屏障中腸上皮結(jié)構(gòu)及緊密連接超微結(jié)構(gòu)。

多種自身免疫性疾病中腸道菌群組成與功能均發(fā)生變化，腸道菌群紊亂可加重免疫發(fā)病進程[13]，疾病進展又可反向加劇腸道菌群紊亂程度[14]。甲狀腺外周穩(wěn)態(tài)對微生物變化敏感，自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展可能受到腸道菌群組成變化的影響[15]。厚壁菌和擬桿菌占腸道菌群的90%以上，是哺乳動物的優(yōu)勢菌群[16]。F/B 與某些病理狀況相關(guān)，被認(rèn)為是腸道菌群健康的重要指標(biāo)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)AIT 大鼠腸道厚壁菌門相對豐度顯著升高，擬桿菌門相對豐度降低，F(xiàn)/B 上升，表明AIT 大鼠腸道菌群門水平物種比例失調(diào)，菌群呈紊亂態(tài)勢，與文獻報道一致[3]；白芍總苷組大鼠腸道厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度升高，F(xiàn)/B 水平降低，門水平菌群紊亂被糾正。在屬水平上，乳酸桿菌屬、普雷沃氏菌屬和羅姆布茨菌屬相對豐度均下降，與AIT 患者腸道菌群分析結(jié)果一致[4]。乳酸桿菌是益生菌的重要來源，能夠通過分泌乳酸、過氧化氫、細菌素等物質(zhì)降低腸道pH，具有殺菌或抑制病原菌黏附、感染的作用[18]。乳酸桿菌能夠降低TNF-α 水平，提高IL-10 水平，并參與調(diào)節(jié)sIgA 的分泌[19-20]。普雷沃氏菌具有定殖性和低致病性，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病中相對豐度較低[21]；普雷沃氏菌能夠利用富含纖維的碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而發(fā)揮抗炎作用[22]。白芍總苷低劑量組大鼠腸道乳酸桿菌屬相對豐度增加，但乳酸桿菌屬對中、高劑量白芍總苷反應(yīng)不敏感，可能由于隨著腸道中藥物的積累，腸道菌群生長受到抑制，導(dǎo)致菌群多樣性及相對豐度下降。

腸黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化學(xué)屏障構(gòu)成[23]，是抵抗有害病原體的第一道防線，對維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用[24]。機械屏障由腸黏膜上皮細胞、緊密連接等組成，其中緊密連接是維持腸黏膜機械屏障功能完整的重要結(jié)構(gòu)[25]。緊密連接蛋白主要包括以O(shè)ccludin為代表的跨膜蛋白和以ZO-1 為代表的胞漿蛋白， Occludin 胞間兩兩相連形成吻合結(jié)構(gòu)而封閉細胞間隙，ZO-1 與前者相互連接，使緊密連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而更加穩(wěn)定。sIgA 是腸黏膜免疫屏障的重要組成部分，與體液及細胞免疫共同發(fā)揮局部免疫功能[26]，具有增強腸道免疫、阻止條件致病菌增殖及病原菌入侵、恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡的作用[27]。本研究結(jié)果顯示，AIT 大鼠結(jié)腸組織sIgA、ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平顯著降低，結(jié)腸黏膜緊密連接超微結(jié)構(gòu)部分?jǐn)嗔寻椴贿B續(xù)，表明緊密連接完整性受損，腸黏膜屏障功能失常；白芍總苷組大鼠結(jié)腸組織sIgA、ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平上調(diào)，結(jié)腸黏膜緊密連接超微結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)，表明腸黏膜屏障功能損傷得到改善。腸道菌群中的正常菌群依靠定殖能力緊密黏附在腸黏膜上，構(gòu)成了腸道的微生物屏障[28]。腸道菌群紊亂可直接損傷微生物屏障，穩(wěn)態(tài)失衡的腸道菌群進而引起一系列復(fù)雜的病理反應(yīng)。同時，腸道菌群的組成受到黏膜免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，細胞間緊密連接功能的強弱又可通過影響腸黏膜通透性決定菌群抗原是否暴露，腸道菌群、緊密連接、腸黏膜免疫屏障之間的相互協(xié)調(diào)作用有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)[29]。此外，短鏈脂肪酸、膽汁酸、吲哚等各類腸道菌群代謝產(chǎn)物在免疫調(diào)節(jié)和疾病發(fā)生中有著不可忽視的作用[30]，因此，腸道菌群代謝產(chǎn)物的變化有待進一步研究。

綜上所述，白芍總苷能夠降低AIT 大鼠甲狀腺自身抗體水平，調(diào)控炎性因子及sIgA，減輕甲狀腺濾泡損傷及結(jié)腸黏膜病變程度，改善結(jié)腸緊密連接超微結(jié)構(gòu)，增加結(jié)腸緊密連接蛋白表達水平，調(diào)節(jié)腸道菌群生物多樣性及物種組成，改善腸黏膜屏障損傷，從而起到治療AIT 的作用。課題組后續(xù)將深入探究乳桿菌等腸道優(yōu)勢菌對AIT 大鼠甲狀腺自身抗體、細胞因子、腸黏膜屏障損傷的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突