朱宗萍，王繼森，廖 婉*，陳 姣，陳 意，楊青松，李 銳*，馬云桐，傅超美

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610045

血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上構(gòu)建新血管的過(guò)程。在正常生理狀況下，體內(nèi)抗血管與促血管因子之間呈動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)機(jī)體受到過(guò)度促血管因子刺激時(shí)，會(huì)導(dǎo)致異常的過(guò)度的病理性血管新生。病理性血管新生是人類惡性腫瘤、心血管疾病和其他疾病發(fā)生發(fā)展的重要進(jìn)程[1]，癌癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等70 余種疾病均與血管過(guò)度生成有關(guān)，因此抗血管新生的研究對(duì)于治療血管新生依賴性疾病具有重要意義[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論雖無(wú)“血管新生”這一概念，但《素問(wèn)·脈要精微論》提出“脈”為氣血運(yùn)行之通道，其中絡(luò)脈主血、入血傷絡(luò)，可見(jiàn)血管新生相關(guān)疾病與中醫(yī)絡(luò)脈的病變密切相關(guān)，中醫(yī)臨床上多選用活血化瘀類中藥治療絡(luò)脈病變[3]。因此，中藥治療病理性血管新生具有一定的理論依據(jù)和優(yōu)勢(shì)。

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖。姜黃屬植物的藥用記載始于《唐本草》[4]，姜黃性辛，味苦、溫，入脾、肝經(jīng)，可破血行氣、通經(jīng)止痛，用于治療胸脅刺痛、胸搏心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、癥瘕、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等癥[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃具有抗炎、調(diào)血脂、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[6-7]。姜黃素和揮發(fā)油類成分為姜黃中的主要活性成分，姜黃素能夠通過(guò)上調(diào)微小核糖核酸-126（microRNA-126，miR-126），負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）和酪氨酸激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5A（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 5，JAK2/STAT5）信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[8]，還能夠通過(guò)影響miR-1275 及miR-1246 的靶基因VEGFB 和核轉(zhuǎn)錄因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）表達(dá)，減少角膜內(nèi)血管生成[9]。姜黃揮發(fā)油成分β-欖香烯能夠下調(diào)原發(fā)性黑色素瘤中血管生成標(biāo)志物CD34 表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。

斑馬魚(yú)是輻鰭亞綱鯉科的一種熱帶硬骨魚(yú)，原產(chǎn)于南亞地區(qū)[11]。由于其基因組序列與人類具有87%的高度相似性，胚胎透明且實(shí)驗(yàn)周期短，被廣泛應(yīng)用于藥物研究[12]。flk1-EGFP 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)常用于心臟、節(jié)間血管、腦血管系統(tǒng)等研究，熒光顯微鏡下血管的內(nèi)皮細(xì)胞呈綠色熒光，可以直接觀察斑馬魚(yú)血管的生成情況，是一種便捷的抗血管新生的體內(nèi)研究模型[13]。本研究以轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)為模式生物，探究姜黃抑制斑馬魚(yú)胚胎血管新生的作用，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，以整體性、系統(tǒng)性的角度闡釋姜黃抗血管新生的作用機(jī)制，為姜黃防治血管新生依賴性疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因型flk1-EGFP 品系斑馬魚(yú)，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)培養(yǎng)和繁殖。

1.2 藥材

姜黃飲片（批號(hào)20200225）購(gòu)自成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)春宇藥堂，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為姜科植物姜黃C.longaL.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

姜黃素（批號(hào)wkq19012802）、去甲氧基姜黃素（批號(hào) 140815）、雙去甲氧基姜黃素（批號(hào)wkq16090905）、芳姜黃酮（批號(hào)wkq20082006）、莪術(shù)醇（批號(hào)wkq16060204）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)C10843959）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；鏈霉蛋白酶（批號(hào)306X014）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；VEGF 受體酪氨酸激酶亞群抑制劑PTK787（批號(hào)18805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.97%）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpres 公司；MS-222、甲基纖維素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.4 儀器

斑馬魚(yú)培育與繁殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生科技發(fā)展有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SMZ-645 型體視顯微鏡、SMZ-1500 型熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 姜黃抗斑馬魚(yú)血管新生作用

2.1.1 供試品溶液的制備

（1）姜黃揮發(fā)油溶液的制備 取姜黃藥材粉末（過(guò)2 號(hào)篩）100 g，采用水蒸氣蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油成分，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL的姜黃揮發(fā)油溶液。

（2）姜黃素溶液的制備 取姜黃素1 mg，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL 的姜黃素溶液。

（3）姜黃水提液的制備 取姜黃藥材粉末（過(guò)5 號(hào)篩）1 mg，加10 倍量水，回流提取1 h，濾過(guò)，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL 的姜黃水提液。

（3）PTK787 溶液的制備 精密稱定PTK787，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL的PTK787 溶液。

2.1.2 姜黃揮發(fā)油溶液和姜黃水提液的質(zhì)量控制

（1）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測(cè)定姜黃揮發(fā)油成分 取姜黃藥材的揮發(fā)油100 μL，用正己烷稀釋50 倍，定容至5 mL 量瓶，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，注入氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[14]。

（2）混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術(shù)醇、芳姜黃酮于5 mL 量瓶中，加甲醇振搖后定容，得到質(zhì)量濃度為0.224、0.241、0.238、0.257、0.232 g/L的混合對(duì)照品溶液。

（3）超高效液相色譜（UPLC）雙波長(zhǎng)法（214 nm、430 nm）測(cè)定姜黃水提液成分 取姜黃藥材粉末（過(guò)5 號(hào)篩）1 g，加10 倍量水，回流提取1 h，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，注入超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[15]。

2.1.3 分組與給藥 取受精后24 h 的斑馬魚(yú)胚胎，采用鏈霉蛋白酶（0.1 mg/mL）脫膜，隨機(jī)分為對(duì)照組、姜黃揮發(fā)油組、姜黃素組、姜黃水提液組和PTK787 組，置于含藥液的24 孔板中，每孔10～15粒胚胎，每孔終體積為1.5 mL，培養(yǎng)板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.1.4 指標(biāo)觀察 采用0.016% MS-222 麻醉斑馬魚(yú)胚胎，調(diào)整斑馬魚(yú)姿勢(shì)，使兩側(cè)眼、體節(jié)重合，采用體式熒光顯微鏡進(jìn)行血管表型觀察，然后于3%甲基纖維素中固定并拍照。觀察完整體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和缺陷ISV 的形態(tài)，以評(píng)估姜黃的抗血管生成活性，根據(jù)體節(jié)間血管生成數(shù)目計(jì)算抑制率。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以±s表示。

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究姜黃抗血管新生的作用機(jī)制

2.2.1 姜黃主要成分和靶點(diǎn)的篩選 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP），以口服生物利用度＞30%且類藥性＞0.10 為篩選條件，對(duì)姜黃的成分進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，確定姜黃的主要成分。采用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及 PharmMapper 服務(wù)器（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）檢索獲取活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)并取合集，應(yīng)用Uniprot（https://sparql.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索得到靶點(diǎn)名稱對(duì)應(yīng)的基因命名，用作后續(xù)研究。

2.2.2 抗血管新生靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 以“antiangiogenesis”“anti-angiogenesis”和“inhibits angiogenesis”為關(guān)鍵詞，在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）中檢索得到與抗血管新生相關(guān)的靶點(diǎn)，運(yùn)用Venny 平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將姜黃主要成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與抗血管新生相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到姜黃抗血管新生的交集靶點(diǎn)。

2.2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將姜黃的主要成分和抗血管新生作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)network analyzer 和cytoNCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，包括度值、介數(shù)以及緊密度，篩選出姜黃抗血管新生的主要活性成分及其主要靶點(diǎn)等信息。

2.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將姜黃抗血管新生的靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），種屬選擇“Homo sapiens”，交互作用選擇＞0.4 的靶點(diǎn)，并隱藏游離的節(jié)點(diǎn)。采用R 語(yǔ)言計(jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)靶點(diǎn)的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量，輸出可視化柱狀圖，用以確定PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建姜黃抗血管新生的PPI 網(wǎng)絡(luò)，按度值大小進(jìn)行分類和排序。

2.2.5 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將姜黃抗血管新生的靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），對(duì)姜黃抗血管新生的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析以及KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選排名靠前的生物過(guò)程和通路，采用R語(yǔ)言以及Cytoscape 3.7.1軟件繪制可視化圖形。

2.2.6 分子對(duì)接模擬 選擇度值排名前8 的活性成分作為配體，“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的核心靶點(diǎn)和PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的核心基因作為受體，采用AutoDock vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能和結(jié)合位點(diǎn)，并作熱圖分析。

3 結(jié)果

3.1 姜黃揮發(fā)油溶液和姜黃水提液的質(zhì)量控制

姜黃揮發(fā)油GC-MS 總離子流色譜圖見(jiàn)圖1-A，定性分析結(jié)果見(jiàn)表1，芳姜黃酮是姜黃揮發(fā)油的主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)29.52%。采用UPLC 雙波長(zhǎng)法對(duì)姜黃水提液進(jìn)行定性，如圖1-B、C 所示，430 nm 處檢測(cè)出姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素，214 nm 處檢測(cè)出芳姜黃酮和莪術(shù)醇。

圖1 姜黃揮發(fā)油GC-MS 總離子流色譜圖 (A)、姜黃水提液 (B) 及混合對(duì)照品溶液 (C) 色譜圖Fig.1 GC-MS total ion flow chromatogram of volatile oil of C.longa (A), chromatography of decoction of C.longa (B), and mixed reference substances solution (C)

3.2 姜黃抗斑馬魚(yú)血管新生作用

如圖2 和表2 所示，與對(duì)照組相比，各給藥組斑馬魚(yú)節(jié)間血管生成缺失且雜亂，呈斷裂趨勢(shì)；各給藥組均具有抑制斑馬魚(yú)血管新生的作用，且呈劑量相關(guān)性。當(dāng)劑量為100、50、25、1 μg/mL 時(shí)，血管生成抑制率排序?yàn)榻S素＞姜黃揮發(fā)油＞姜黃水提液；當(dāng)劑量為10 μg/mL 時(shí)，血管生成抑制率排序?yàn)榻S揮發(fā)油＞姜黃素＞姜黃水提液；當(dāng)劑量為1 μg/mL 時(shí)，各給藥組斑馬魚(yú)血管新生抑制率均較低，個(gè)別呈現(xiàn)無(wú)抑制作用。此外，各劑量給藥組均無(wú)致胚胎死亡和致胚胎畸形的趨勢(shì)。

表1 姜黃揮發(fā)油成分鑒定Table 1 Identification of ingredient in volatile oil of C.longa

圖2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的影響 (×100)Fig.2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis (× 100)

3.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究姜黃抗血管新生的作用機(jī)制

3.3.1 姜黃主要成分的篩選 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出姜黃化學(xué)成分52 個(gè)，通過(guò)口服生物利用度＞30%且類藥性＞0.10，共篩選得到活性成分14 個(gè)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)姜黃素、β-欖香烯等成分雖然口服生物利用度差，但具有較好的生物活性和類藥性，因此，整合數(shù)據(jù)后共得到活性成分21 個(gè)，見(jiàn)表3。

表2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的影響 ( ± s , n=6)Table 2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis ( ± s , n=6)

表2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的影響 ( ± s , n=6)Table 2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis ( ± s , n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05*P< 0.05 vs control group

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) 血管生成數(shù)/條 血管生成抑制率/% 對(duì)照 — 22±2 — PTK787 0.025 12±3* 46.21±12.33 0.050 5±1* 77.27±4.06 0.100 2±1* 90.91±4.97 0.200 0±1* 99.24±1.85 姜黃揮發(fā)油 1 18±1* 18.18±5.74 10 16±1* 26.52±5.31 25 12±3* 43.94±11.73 50 10±2* 53.03±10.62 100 6±1* 73.48±6.04 姜黃素 1 19±2* 15.91±8.50 10 13±4* 40.15±20.41 25 8±2* 65.15±8.93 50 5±2* 77.27±9.53 100 3±1* 86.36±4.98 姜黃水提液 1 20±2 10.61±9.81 10 19±3* 15.91±12.44 25 16±2* 28.79±7.42 50 13±3* 41.67±11.99 100 10±2* 54.55±7.04

表3 姜黃主要活性成分Table 3 Main active ingredients of C.longa

3.3.2 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)得到姜黃21 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到靶點(diǎn)950 個(gè)。以相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥5 為篩選條件，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到與抗血管新生相關(guān)靶點(diǎn)1416 個(gè)。利用Venny 平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行交集，得到106 個(gè)抗血管新生相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

3.3.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖3 所示，黃色代表姜黃，綠色代 表姜黃主要活性成分，粉色代表抗血管相關(guān)靶點(diǎn)，顏色越淺，節(jié)點(diǎn)越小，其度值越小?！八幬?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖共有126 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中靶點(diǎn)106 個(gè)，姜黃主要活性成分19 個(gè)，通過(guò)CytoNCA 插件分析發(fā)現(xiàn)姜黃抗血管新生最主要的前8 種活性成分分別為姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術(shù)醇、雙去甲氧基姜黃素、豆甾醇、吉馬酮、β-欖香烯和芳姜黃酮。以2 倍中位數(shù)值共選取28 個(gè)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，包括前列腺素G/H 合酶2/1（prostaglandin G/H synthase 2/1，（PTGS2/PTGS1）、維生素D3 受體（vitamin D3 receptor，VDR）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、維甲酸受體-α（retinoic acid receptor-α，RXRA）等。

圖3 姜黃“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 “Drug-component-target” network of C.longa

3.3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 如圖4 所示，PPI網(wǎng)絡(luò)共有106 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1181 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為22.3，平均局部聚類系數(shù)為0.576。節(jié)點(diǎn)越大，顏色由淺黃到橙色，表明靶點(diǎn)度值越大，AKT1、血清白蛋白（albumin，ALB）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等靶點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。根據(jù)二倍中位數(shù)值進(jìn)行篩選，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因21 個(gè)，采用R語(yǔ)言可視化為柱狀圖。

圖4 姜黃抗血管新生PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及核心基因柱狀圖Fig.4 PPI network of C.longa anti-angiogenesis and core gene column

3.3.5 GO 功能與KEGG 通路分析 借助DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的28 個(gè)核心靶點(diǎn)以及21 個(gè)PPI 核心基因進(jìn)行GO 富集分析，共得到226 個(gè)GO條目，其中生物過(guò)程條目159 個(gè)、細(xì)胞組成條目27個(gè)、分子功能條目40 個(gè)。根據(jù)P＜0.01，取排名前10 的條目制作條形圖見(jiàn)圖5。姜黃抗血管生成涉及RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡及增殖過(guò)程的調(diào)控、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等生物過(guò)程，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、高爾基體等細(xì)胞組成，酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白結(jié)合、胰島素受體結(jié)合、鋅離子結(jié)合等分子功能。

圖5 姜黃抗血管新生GO 分析Fig.5 GO analysis of C.longa anti-angiogenesis

采用DAVID 數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行KEGG 通路分析， 共富集到116 條通路，根據(jù)P＜0.05，取P值最小的前20 條通路，采用R 語(yǔ)言繪制氣泡圖，Cytoscape 3.7.1 繪制“靶點(diǎn)-通路”圖，如圖6 所示，姜黃抗血管新生主要涉及VEGF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等，同時(shí)姜黃活性成分還參與了前列腺癌、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、動(dòng)脈粥樣硬化、乳腺癌、膀胱癌、激活血小板、結(jié)直腸癌等信號(hào)通路，可見(jiàn)姜黃能夠通過(guò)抗血管新生機(jī)制來(lái)改善動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等疾病。

圖6 姜黃抗血管新生KEGG 分析和“靶點(diǎn)-通路”圖Fig.6 KEGG analysis of C.longa anti-angiogenesis and “target-pathway” network

3.3.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 對(duì)度值排名前8 的活性成分與網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn)以及PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因進(jìn)行分子對(duì)接，最低結(jié)合能熱圖見(jiàn)圖7，橫坐標(biāo)為核心靶點(diǎn)，縱坐標(biāo)為姜黃的活性成分及抗血管新生臨床常用藥物索拉菲尼，顏色的深淺代表最低結(jié)合能大小，活性成分與靶點(diǎn)的最低結(jié)合能均小于0，表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。吉馬酮10 個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，豆甾醇與6 個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，β-欖香烯、芳姜黃酮與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力也較好，莪術(shù)醇與7 個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol。各主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模擬圖見(jiàn)圖8，莪術(shù)醇與VDR 的結(jié)合能力最好，對(duì)其做構(gòu)象簇聚類分析見(jiàn)圖9，莪術(shù)醇與VDR 在LYS-321 結(jié)合位點(diǎn)處形成 最優(yōu)構(gòu)象。簇分析發(fā)現(xiàn)，在-4.8 kJ/mol 處聚類最多，且所有構(gòu)象結(jié)合能均小于0，表明莪術(shù)醇與VDR 結(jié)合較好。姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素雖是姜黃抗血管新生度值較高的活性成分，但與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能普遍較低，可能與其水溶性差、生物利用度較低有關(guān)。

圖7 姜黃主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖Fig.7 Heat map of binding energy between major active components of C.longa and key targets

圖8 姜黃主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模擬圖Fig.8 Simulation diagram of docking between main active components of C.longa and key targets

圖9 莪術(shù)醇-VDR 集成構(gòu)象交互直方圖與分子對(duì)接圖Fig.9 Curcumol-VDR integrated conformation interaction histogram and molecular docking diagram

4 討論

斑馬魚(yú)是研究血管生成的新型模式生物，其血管發(fā)育開(kāi)始于原腸胚形成時(shí)期，與包括人類在內(nèi)的高級(jí)脊椎動(dòng)物非常相似，并貫穿于整個(gè)生命過(guò)程[16]。flk1-EGFP 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)GFP 熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在藍(lán)色熒光下其血管呈綠色。普通哺乳動(dòng)物如鼠、家兔等的血管深藏體內(nèi)不易觀察，解剖行為會(huì)對(duì)血管造成一定的破壞；經(jīng)典血管模型雞胚絨毛尿囊膜模型雖具有一定的透明度，但其尿囊膜本身存在的血管會(huì)影響藥物作用后新生血管計(jì)數(shù)，且雞和人的種屬差異也會(huì)使體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床試驗(yàn)結(jié)果存在較大差異[17]。斑馬魚(yú)因與人類基因的高度相似性及其胚胎獨(dú)特的光學(xué)清晰度，成為了體內(nèi)血管動(dòng)態(tài)生成研究的高通量、高效率的優(yōu)勢(shì)模式生物。本研究基于模式生物斑馬魚(yú)比較姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對(duì)血管的抑制作用，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藥物質(zhì)量濃度為1000、500、100、1 μg/mL 時(shí)，各給藥組均對(duì)斑馬魚(yú)血管生成有抑制作用；藥物質(zhì)量濃度為1000、500 μg/mL時(shí)具有明顯的致畸作用，還有較強(qiáng)的胚胎致死作用，因此，本研究選取1～100 μg/mL 的質(zhì)量濃度研究姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的抑制作用。

本研究構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析姜黃活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，預(yù)測(cè)得到8 個(gè)姜黃抗血管新生關(guān)鍵活性成分，其中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素屬于姜黃素類，芳姜黃酮、吉馬酮、β-欖香烯、莪術(shù)醇為倍半萜類，豆甾醇為植物甾醇類[4]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃活性成分具有明顯的血管新生調(diào)控作用。3 種姜黃色素類成分均能下調(diào) VEGF、黏附分子-1（intercellular adhesion molecul-1，ICAM-1）[18]和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達(dá)[19]，抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 HemECs、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 的增殖[20]。姜黃揮發(fā)油組分能夠明顯抑制人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，且明顯對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制作用[21]。芳姜黃酮為姜黃揮發(fā)油中的特征性成分，其含量最高可達(dá)姜黃揮發(fā)油類成分的50%[22]，能夠抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1增殖及其成管萌芽管的形成，且對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和C57BL/6 小鼠的血管形成均有明顯的抑制作用[23]。吉馬酮抑制血管新生研究多集中在腫瘤領(lǐng)域，能夠通過(guò)降低 VEGF 表達(dá)，調(diào)控非小細(xì)胞肺癌NCI-H1770 細(xì)胞的增殖和凋亡[24]。莪術(shù)醇能夠下調(diào)NF-κB 和VEGF 表達(dá)，從而抑制人肺癌A549 細(xì)胞增殖[25]， 還可通過(guò)調(diào)控環(huán)氧合酶-2（ cyclooxygenase-2 ， COX-2 ） / 前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）/VEGF 信號(hào)通路，抑制結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)[26]。β-欖香烯能夠明顯抑制胃癌干細(xì)胞GCSCs 腫瘤微血管的生成[27]。豆甾醇能夠下調(diào)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表達(dá)水平，抑制小鼠腫瘤血管生成和膽管癌移植瘤生長(zhǎng)[28]。

PTGS2 和VDR 是“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PTGS2 是COX 的誘導(dǎo)型即刻反應(yīng)基因，是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵性限速酶，主要參與炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤新生等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 可能以VEGF為重要介質(zhì)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌血管生成[30]，目前雖有較多關(guān)于姜黃干預(yù)血管新生的研究，但姜黃通過(guò)PTGS 調(diào)控血管新生的報(bào)道較少，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。VDR 與RXR 形成異源二聚體，抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，對(duì)糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的保護(hù)作用[31]。對(duì)姜黃的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)AKT1 和ALB 是核心靶點(diǎn)，AKT1 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞增殖和血管生成，姜黃素能夠通過(guò)下調(diào)AKT 表達(dá)，抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管生成[32]。ALB 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血液的膠體滲透壓，目前有關(guān)ALB 直接調(diào)節(jié)血管新生的報(bào)道較少，但ALB 能夠影響血管通透性，高通透性血管有利于腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)以及促血管生成因子的生成和局部聚集，提示后續(xù)可對(duì)此進(jìn)行深入研究。

GO 功能和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，姜黃能夠通過(guò)作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)自身磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、酶結(jié)合、血紅素結(jié)合等功能。姜黃對(duì)癌癥具有明顯的改善作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，還能夠延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，但其研究多集中在姜黃單一成分或單一通路上，忽略中藥的多成分、多靶點(diǎn)以及中醫(yī)整體觀的理念，本研究從整體性及系統(tǒng)性的角度闡釋姜黃抗血管生成的作用。

綜上所述，姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液均具有明顯的抗斑馬魚(yú)血管新生的作用，姜黃素類、倍半萜類和植物甾醇類成分可能是姜黃抗血管生成的主要活性成分，可與AKT、ALB、CASP3、PEGS2、VDR、PGR 等靶點(diǎn)以氫鍵作用結(jié)合，通過(guò)RNA 調(diào)控、蛋白質(zhì)自身磷酸化、細(xì)胞功能等調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路以及癌癥通路等，從而發(fā)揮抑制血管生成的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突