相亞楠，王靈超，高 尤，羅龍龍，張文鵬，莊笑梅

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）屬于黃病毒科黃病毒屬的B群蟲媒病毒，病毒成球形，直徑約50 nm，為單層囊膜結(jié)構(gòu)，囊膜上有一層薄層突起，呈棒狀結(jié)構(gòu)［1-3］。WNV全基因組由約11 kb核苷酸組成，屬不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒［4］。WNV于1937年在西尼羅河地區(qū)一位發(fā)熱的成年婦女血液中分離得到，因此命名為西尼羅河病毒［5］。西尼羅河熱（West Nile fever，WNF）是由WNV引起的一種人畜共患病，主要經(jīng)蚊傳播，可導(dǎo)致人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡，也可引起馬、禽類和貓等動物發(fā)?。?］。

WNV病在非洲、中東、西部及中部亞洲、大洋洲和歐洲部分地區(qū)廣泛流行，自1999年起首次在北美洲大面積流行。最近，先后于1994年在阿爾及利亞、1996-1997年在羅馬尼亞、1999-2002年在美國發(fā)生WNV病導(dǎo)致的腦炎病例［7-9］。目前我國尚無WNV病發(fā)病的報道。隨著國際交流增多、商貿(mào)交易頻繁以及鳥類遷徙，該病有傳入我國的風(fēng)險，因此必須高度警惕WNF在國內(nèi)的傳播。

目前尚無批準上市的疫苗及藥物用于人感染W(wǎng)NV的預(yù)防和治療。2003年，美國批準馬用甲醛溶液滅活WNV疫苗上市，其保護效率可達94%，但必須每年加強注射［10］。與疫苗需要提前注射相比，抗體藥物用于感染后治療，受試人群縮小，節(jié)約了人力、物力和財力，因此開發(fā)抗WNV治療性抗體迫在眉睫。迄今已有數(shù)個單抗藥物進入非臨床研究（如CR4348和CR4354）以及臨床Ⅱ期試驗（如hE16和pE16），但其最終能否被批準用于臨床治療仍面臨許多挑戰(zhàn)［11］。MIL94是由軍事醫(yī)學(xué)研究院研究的抗WNV全人源單抗，該抗體是由CHO細胞表達產(chǎn)生，具有免疫原性低、不受季節(jié)影響、生產(chǎn)力高等優(yōu)勢。前期小鼠染毒實驗結(jié)果顯示能全保護（數(shù)據(jù)未公開），正在進行系統(tǒng)非臨床藥動學(xué)研究。

本研究擬優(yōu)化建立一種特異、靈敏的定量檢測食蟹猴血清中MIL94濃度的間接ELISA，經(jīng)全面驗證后，進行食蟹猴體內(nèi)藥動學(xué)的初步研究。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

普通級食蟹猴12只，北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（京）2015-0011；年齡3～4歲，體重2.5～3.5 kg，實驗期間動物自由取食、飲水，食蟹猴接受的所有操作均符合本單位實驗動物倫理委員會規(guī)定（IACUC-DWZX-2020-627）。

MIL94標準品（7.2 g·L-1，批號：190410，軍事醫(yī)學(xué)研究院）；食蟹猴空白血清（批號：20190928，北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司）；抗原：envelope protein（domain Ⅲ，His Tag）（貨號：40345-V08Y，美國Sino Biological公司）；二抗：辣根過氧化物標記的羊抗人IgG（貨號：SE101，北京Solarbio公司）；TMB顯色液（貨號：00-4201-56，美國invitrogen公司）；洗滌液PBST溶液（含0.05% Tween 20的PBS（自行配置）；pH 7.4 PBS（貨號：C10010500BT，美國Gibco公司）；酪蛋白封閉液（貨號：C5890，美國Sigma公司）；氮化鈉注射液（批號：2006103205，石家莊四藥有限公司）。

SPECTRO starNano型酶標儀（德國BMG LABTECH公司）；微量加樣器（美國Eppendorf公司）；離心機和96孔板（美國Thermo公司）；微量振蕩器（廣州SCILOGEX公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；洗板機（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心）；促凝采血管（美國BD公司，添加SST Amber高分子凝膠促凝）。

1.2 間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELlSA）

①包被：用包被緩沖液將WNV抗原稀釋到1 mg·L-1，于酶標板中每孔加100 μL包被，4℃包被過夜。②洗滌：用洗板機反復(fù)洗板5次，拍干。③封閉：每孔加200 μL酪蛋白封閉液，37℃孵育1 h。④洗滌：用洗板機反復(fù)洗板5次，拍干。⑤加樣品：用空白食蟹猴血清稀釋系列濃度（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1）的MIL94制備成標準曲線樣品，同法配制0.5，1.6和25 mg·L-1MIL94質(zhì)控樣品，每孔加100 μL，每個樣品平行做2孔，37℃孵育2 h。⑥洗滌：用洗板機洗板5次，拍干。⑦酶標抗體：用二抗稀釋液按1∶10 000稀釋HRP標記的羊抗人IgG，每孔加100 μL，37℃避光孵育1 h。⑧ 洗滌：用洗板機反復(fù)洗板5次，拍干。⑨顯色：每孔加100 μL TMB顯色液，室溫避光放置10 min。⑩ 終止：每孔加100 μL 2N H2SO4終止液終止反應(yīng)。?測定：酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值（A450nm）。

數(shù)據(jù)處理：將標準曲線樣品濃度值（X）與所測定的吸光值（Y）利用SPECTRO starNano軟件的四參數(shù)法進行擬合，根據(jù)得到的四參數(shù)方程式計算待測樣品的濃度。四參數(shù)擬合方程為：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope）。其中Top為擬合曲線的上端漸進線的估計值（A值），Bottom為擬合曲線的下端漸進線的估計值（A值），Slope為校正曲線的斜率，X為實測濃度，EC50為50%吸光度值對應(yīng)的樣品濃度，通過擬合最優(yōu)的曲線作為校正曲線。

方法學(xué)驗證：按生物樣品臨床前藥動學(xué)指導(dǎo)原則要求，進行了特異性、精密度和準確度、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、平行性選擇性和穩(wěn)定性等全面驗證。

1.3 藥動學(xué)實驗

給藥方案：12只食蟹猴隨機分為2組，每組6只，雌雄各半給藥劑量為5和100 mg·kg-1。給藥量按食蟹猴體重計算，推注前用注射用生理鹽水將MIL94稀釋至所需濃度，控制推注速度確保食蟹猴在30 min內(nèi)推注完畢。

血清樣品的制備：給藥前采集食蟹猴空白血，并分別于給藥開始后5 min、給藥結(jié)束即刻、給藥開始后1，2，4，8，24 h，3，5，7，10，14，21，28，35，42，49，56和63 d于頭靜脈采血，每次采血量約1 mL，置促凝離心管中。全部血樣均于室溫凝固30 min后，4℃，2500×g離心10 min獲得血清，分裝后于-40℃凍存，待測。

數(shù)據(jù)處理：用WinNonlin軟件，按非房室統(tǒng)計矩模型計算靜脈推注給藥后食蟹猴的主要藥動學(xué)參數(shù)：曲線下面積（area under curve，AUC），清除率（clearance，Cl），穩(wěn)態(tài)表觀分布容積（steady state apparent distribution volume，Vss），消除半衰期（half life，t1/2）和平均駐留時間（mean residence time，MRT）。采用 Microsoft EXCEL（2010）計算均值，使用GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果

2.1 食蟹猴血清中MlL94 ELlSA方法學(xué)驗證

2.1.1 標準曲線

測定濃度為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1的10個標準曲線樣品，0.125和64 mg·L-1作為錨定點，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔。結(jié)果表明，MIL94在0.25～32 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度的對數(shù)值與A值呈S形曲線（圖1）。

Fig.1 Standard curve of MlL94 in cynomolgus monkey serum sample obtained by four parameters fitting method.The logarithmic concentration value of the standard curve is an S-shaped curve with the response value.The standard curve ranges in concentration 0.125-64 mg·L-1.The fourparameter fitting equation is：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope），r2＞0.99.Top is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the upper end of the fitting curve.Bottom is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the lower end of the fitting curve.Slope is the slope of the correction curve.X is the measured concentration.EC50is the sample concentration corresponding to 50% light absorption value，and the optimal fitting curve is used as the correction curve.

2.1.2 特異性

采用該ELISA考察人IgG與WNV抗原包被板的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，人IgG與MIL94不存在交叉反應(yīng)，食蟹猴血清基本無反應(yīng)本底（表1）。

Tab.1 Concentration of MlL94 measured after adding different doses of human-lgG

2.1.3 精密度和準確度

按制備標準曲線的方法制成MIL94 0.5，1.6和25 mg·L-1的質(zhì)控樣品，通過建立的方法進行測定，計算板間與板內(nèi)的精密度，由同一板上的標準曲線回歸方程計算出各濃度MIL94的檢出量。準確度范圍分別為板內(nèi)105.4%～108.1%，板間98.0%～106.9%；精密度分別為板內(nèi)1.18%～4.62%，板間8.19%～10.2%。均符合生物樣品分析方法驗證M10中的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accuracy of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.4 稀釋線性和鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）

由于MIL94在食蟹猴體內(nèi)藥動學(xué)實驗中給藥劑量較大，實際血清樣品濃度較高，超出了標曲定量范圍，需要進行稀釋，因此對血清樣品的稀釋準確度進行考察。而抗體濃度過高時可能出現(xiàn)抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性現(xiàn)象，因此需要考察鉤狀效應(yīng)［12］。用食蟹猴混合空白血清分別稀釋3個MIL94高濃度樣本（1000，2000和4000 mg·L-1）作為鉤狀效應(yīng)樣本，然后分別稀釋1000，2000和4000倍至1 mg·L-1作為稀釋線性樣本進行驗證。鉤狀效應(yīng)樣本最高濃度選擇4000 mg·L-1是因為此濃度與MIL94食蟹猴高劑量給藥時體內(nèi)血藥濃度一致。實驗結(jié)果表明，稀釋線性滿足要求，鉤狀效應(yīng)樣本的A值與標曲高點響應(yīng)一致，該劑量下無明顯的鉤狀效應(yīng)（表3）。

Tab.3 Linear dilution of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.5 平行性

平行性考察不同的稀釋倍數(shù)是否對測量結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響。選取3個真實樣本，用空白食蟹猴混合血清將3個樣本分別稀釋不同倍數(shù)（1000，2000和5000倍）至標準曲線范圍內(nèi)。結(jié)果表明，3個樣本的RSD（%）介于7.4%～16.9%，在最高稀釋倍數(shù)（5000倍）下，不會對樣品的準確度造成影響。

2.1.6 選擇性

準備10個單只食蟹猴空白血清樣本，每個血清樣本制備1個空白樣本，1個定量下限樣本（low limit of detection，LLOQ），1個高濃度質(zhì)控樣本（high concentration quality control，HQC）。結(jié)果表明，10個空白食蟹猴血清樣本回算濃度均低于LLOQ，MIL94的LLOQ與HQC的血清樣本檢測的準確度分別介于96.8%～118.8和99.13%～116.59%之間，滿足生物樣品驗證指導(dǎo)原則M10的要求。

2.1.7 穩(wěn)定性

低濃度質(zhì)控（low concentration quality control，LQC），HQC的樣本配制即刻（C0），常溫放置4 h，-40℃放置7，14和28 d及反復(fù)凍融3次和5次后（每個濃度水平3個樣本）測定，樣品凍存至28 d穩(wěn)定，可用于食蟹猴靜脈推注MIL94后藥動學(xué)評價（表4和表5）。

Tab.4 Short-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

Tab.5 Long-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

2.2 單次靜注不同劑量MlL94后食蟹猴體內(nèi)藥動學(xué)特征

單次靜注不同劑量后MIL94在食蟹猴體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線見圖2。用WinNonlin軟件，按非房室統(tǒng)計矩模型計算靜脈給藥后食蟹猴的主要藥動學(xué)參數(shù)（表6）。結(jié)果提示，MIL94食蟹猴靜推給藥后，兩劑量組間t1/2、Vss、MRT較為接近，體內(nèi)暴露量AUC與給藥劑量基本成線性，Vss與食蟹猴血清容量一致，說明MIL94主要分布在血液中MRT較長，在10 d以上。

Fig.2 Mean serum concentration-time curves of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected.Four cynomolgus monkeys were randomly divided into 2 groups with 2 monkeys in each and the drug doses were 5 and 100 mg·kg-1.The dosage was calculated according to the body mass of the cynomolgus monkeys.The route of administration was intravenous injection（IV）.MIL94 was diluted to the required concentration with 0.9% normal saline before infusion，and the infusion speed was controlled to ensure that the cynomolgus monkeys were injected within 30 minutes.The X axis represents the time of blood collection，and the Y axis represents the serum drug concentration.x±s，n=6.

Tab.6 Main pharmacokinetic parameters of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected

3 討論

本研究建立的間接ELISA檢測方法的定量下限0.25 mg·L-1，線性范圍達＞125倍。方法開發(fā)時有3個關(guān)鍵點：①洗滌緩沖液篩選了PBS和含不同比例Tween 20的PBS，結(jié)果表明洗滌緩沖液（PBST）中添加0.05%表面活性劑Tween 20時洗脫能力最好；②單一成分的封閉液無法達到完全封閉的效果，嘗試了BSA、酪蛋白、脫脂奶粉等蛋白進行優(yōu)化，最終選擇10%脫脂奶粉作為封閉液，稀釋液體積比為PBS∶PBST∶酪蛋白=2∶1∶1；③ 方法建立后先考察特異性，確證本法能排除相關(guān)基質(zhì)干擾，再進行精密度、準確度等考察。通過對以上關(guān)鍵點的優(yōu)化，結(jié)果表明，建立的食蟹猴血清中MIL94的間接ELISA檢測方法在特異性、準確度、精密度、稀釋線性和穩(wěn)定性等方面均符合生物樣品分析指導(dǎo)原則M10［13］的要求，可用于食蟹猴血清MIL94的定量檢測。

單抗藥物在體內(nèi)的分布和清除過程與新生兒Fc受 體（Neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）密 切 相關(guān)［14-16］，而FcRn與單抗的結(jié)合具有種屬特異性。由于MIL94是全人源化單抗，通過與人體hFcRn特異結(jié)合而介導(dǎo)其組織分布和轉(zhuǎn)運。在非臨床研究階段，由于物種差異，動物體內(nèi)的藥動學(xué)特征很難外推到臨床。從動物種屬來說，非人靈長類實驗動物與人類的遺傳物質(zhì)有75%～98.5%同源性［17-18］，是最接近人的物種。因此，采用食蟹猴進行臨床前藥動學(xué)研究意義極大。

食蟹猴靜注MIL94 5和100 mg·kg-1后，體內(nèi)藥動學(xué)特征顯示，在5～100 mg·kg-1給藥劑量范圍內(nèi)，AUC與給藥劑量基本成比例；Cl很低，且不隨給藥劑量改變；末端t1/2＞10 d。Vss也不隨給藥劑量改變，且與食蟹猴血容量相當（45 mL·kg-1）［19-20］，提示MIL94作為大分子類單抗藥物，難以透過細胞膜進入組織，主要在循環(huán)血液中分布，其分布和排泄特征正在大鼠體內(nèi)進行研究。

綜上，本研究建立的間接ELISA測定食蟹猴血清中MIL94濃度的方法滿足非臨床藥動學(xué)研究需求，并初步獲得了MIL94在食蟹猴中線性暴露和消除的藥動學(xué)特征，為MIL94的非臨床及臨床藥動學(xué)系統(tǒng)研究提供了支持。