張傳英， 彭 鑫*， 饒恒軍， 齊 崴， 蘇榮欣， 何志敏

1. 天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津市生物大分子結(jié)構(gòu)功能與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300072 2. 天津大學(xué)化工學(xué)院， 化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300072

引 言

丹酚酸B(Salvianolic acid B， SAB)(圖1)， 一為縮酚酸類多羥基化合物， 可從唇形科多年生草本植物丹參的干燥根及根莖中提取得到[1]。 作為丹參中含量最高的水溶性成分， SAB具有很強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基功能， 是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一[2]。 目前， 對(duì)SAB生物活性已進(jìn)行廣泛的研究， 但對(duì)其在體內(nèi)的生物行為如吸收、 運(yùn)輸、 分布及排泄等還知之甚少。 開展SAB的藥代動(dòng)力學(xué)研究， 將會(huì)對(duì)SAB的療效機(jī)制研究及臨床用藥提供幫助。

圖1 丹酚酸B結(jié)構(gòu)式

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)(大約占60%)， 能夠與許多物質(zhì)相結(jié)合， 起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)作用[3]。 藥物從給藥部位進(jìn)入人體后， 在循環(huán)系統(tǒng)中都要不同程度地與血清白蛋白發(fā)生可逆結(jié)合。 而結(jié)合后的藥物不易穿透毛細(xì)血管壁， 故使其不能到達(dá)病灶部位， 進(jìn)而影響其發(fā)揮療效。 此外， 結(jié)合小分子后血清白蛋白的空間構(gòu)象和生理功能都會(huì)受到影響， 這對(duì)于理解蛋白結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系， 以及解釋某些生理過程具有很大的促進(jìn)作用[4]。 因此， 研究天然產(chǎn)物與蛋白質(zhì)之間的相互作用已成為生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。

目前， 關(guān)于SAB與血清白蛋白的相互作用研究已有一些報(bào)道。 Chen等利用光譜法研究SAB與人血清白蛋白(HSA)的相互作用， 發(fā)現(xiàn)SAB對(duì)HSA的猝滅為靜態(tài)猝滅[6]。 王月榮等運(yùn)用電化學(xué)方法研究SAB與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合， 發(fā)現(xiàn)兩者之間形成結(jié)合比約為2: 1的復(fù)合物[7]。 而關(guān)于用核磁共振波譜和三維熒光光譜研究SAB對(duì)血清白蛋白構(gòu)象的影響以及分析SAB在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)等研究還未見報(bào)道。 通常利用熒光光譜技術(shù)可以得到小分子與蛋白質(zhì)互作過程中的一些機(jī)制參數(shù)， 如結(jié)合常數(shù)、 主要結(jié)合力、 結(jié)合部位及蛋白結(jié)構(gòu)變化等。 圓二色光譜則可以表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象在結(jié)合小分子前后是否發(fā)生改變， 而核磁共振波譜技術(shù)可以分析小分子的哪些基團(tuán)與蛋白發(fā)生了相互作用。 本工作以BSA為模型蛋白， 運(yùn)用熒光光譜、 圓二色光譜和核磁共振波譜研究SAB與BSA的相互作用， 獲得兩者在互作過程中的結(jié)合機(jī)制信息， 并考察SAB的結(jié)合對(duì)BSA空間構(gòu)象的影響。 這些研究對(duì)于從分子水平上理解SAB在血液中的存儲(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及藥理作用具有重大的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Fluorolog3型穩(wěn)態(tài)、 瞬態(tài)熒光光譜儀(法國(guó)Horiba Jobin Yvon公司)； Cary Eclipse型熒光光譜儀(美國(guó)Varian公司)； J-810型圓二色譜儀(日本Jasco公司)； AVANCE III 600 MHz型核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司)。

BSA購(gòu)于Sigma公司， 用PBS緩沖液(pH為7.4， 含0.1 mol·L-1的NaCl)配制濃度為1.0×10-5和1.0×10-4mol·L-1的兩種儲(chǔ)備液， 避光置于4 ℃冰箱保存； 布洛芬和洋地黃毒苷購(gòu)于Sigma公司， 華法林購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所， 三者均溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液， 配制濃度為2.5×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液； 其余試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜測(cè)定

配制10種不同濃度的BSA-SAB混合液， 使得SAB與BSA的摩爾濃度比分別為0， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 10， 12。 BSA在所有反應(yīng)體系中最終測(cè)試濃度均為5.0×10-6mol·L-1。 置于恒溫水浴中保溫10 min， 然后于熒光光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)。 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2 nm， 激發(fā)波長(zhǎng)分別為280和295 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)范圍分別為290～500和305～500 nm。 考慮內(nèi)濾光效應(yīng)的影響， 實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)都進(jìn)行熒光校正。 配制5種不同濃度比的BSA-SAB混合液， 在295 nm處測(cè)定樣品的瞬態(tài)熒光光譜， 然后用儀器自帶軟件計(jì)算得到熒光壽命。 分別測(cè)定BSA與BSA-SAB體系的三維熒光光譜， 激發(fā)波長(zhǎng)范圍為200～360 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)范圍為230～550 nm， 波長(zhǎng)間隔為10 nm。

1.2.2 位點(diǎn)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

在比色管中加入3 mL的BSA-SAB混合液， 使其摩爾濃度比為1∶4(BSA濃度為5.0×10-6mol·L-1， SAB濃度為2.0×10-5mol·L-1)， 然后依次加入不同量的位點(diǎn)標(biāo)記試劑(華法林、 布洛芬、 洋地黃毒苷)， 在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 圓二色光譜測(cè)定

遠(yuǎn)紫外圓二色實(shí)驗(yàn)： 配制5種不同濃度比的BSA-SAB混合液， 蛋白終濃度為2.5×10-6mol·L-1， 在室溫下掃描其圓二色譜圖。 比色皿池徑為2 mm， 掃描波長(zhǎng)為200～260 nm。 在測(cè)試過程中SAB溶液作為空白背景被自動(dòng)扣除。 近紫外圓二色實(shí)驗(yàn)： 配制4種不同濃度比的BSA-SAB混合液， 蛋白終濃度為1.0×10-5mol·L-1， 在室溫下將樣品置于10 mm的石英比色皿中， 掃描其260～320 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的圓二色譜圖。

1.2.4 核磁共振波譜測(cè)定

用重水配制3種不同摩爾濃度比(0， 0.01， 0.1)的BSA-SAB混合液， 使得SAB的終濃度為2.5×10-3mol·L-1。 在室溫下孵育2 h使其充分反應(yīng)， 然后分別采用5 mm核磁管進(jìn)行1H NMR實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與SAB相互作用的熒光光譜分析

2.1.1 熒光猝滅機(jī)理

圖2(a)為BSA與SAB相互作用的熒光光譜圖。 由圖可見， SAB在280 nm激發(fā)下不發(fā)射熒光(曲線0)。 SAB的加入使得BSA在345 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低， 且峰位置出現(xiàn)明顯的紅移， 表明SAB的存在下BSA熒光發(fā)生猝滅。 此外， 在453 nm左右出現(xiàn)了一個(gè)等強(qiáng)度發(fā)射點(diǎn)， 這是由于BSA與SAB之間形成了不發(fā)射熒光的復(fù)合物所造成的。 這些變化說明BSA與SAB之間發(fā)生相互作用， 使得蛋白色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖2 298 K溫度下BSA-丹酚酸B體系的熒光光譜圖(a), Stern-Volmer曲線圖(b), 時(shí)間分辨熒光衰減曲線圖(c)和BSA-丹酚酸B體系的內(nèi)源熒光強(qiáng)度和熒光壽命的Stern-Volmer曲線圖(d)

熒光猝滅通?？煞譃槿N類型： 靜態(tài)猝滅、 動(dòng)態(tài)猝滅以及動(dòng)靜態(tài)聯(lián)合猝滅[4]。 為了確定猝滅機(jī)制， 利用Stern-Volmer方程對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[3]

F0/F=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0和F分別為SAB加入前后BSA的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；kq是雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0是在無猝滅劑存在下的熒光分子的平均熒光壽命(一般為10-8s)； [Q]是SAB的濃度。 根據(jù)式(1)， 以F0/F對(duì)[Q]作圖[圖2(b)]。 由圖可見， Stern-Volmer曲線在高濃度時(shí)是向上偏向y軸的曲線， 說明BSA的熒光猝滅既涉及靜態(tài)猝滅又涉及動(dòng)態(tài)猝滅。 因?yàn)槿绻淮嬖趩为?dú)一種猝滅方法， Stern-Volmer曲線應(yīng)該是線性的。 此外， 在低濃度區(qū)域內(nèi)， 可以看出Stern-Volmer曲線是線性的， 故可計(jì)算得到Ksv和kq(表1)。 由表可知，Ksv值隨著溫度的升高逐漸變小， 且所有溫度下的kq值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1， 說明SAB對(duì)BSA的猝滅以是靜態(tài)猝滅為主[4]。

表1 BSA-丹酚酸B體系的猝滅常數(shù)、 猝滅速率常數(shù)和結(jié)合常數(shù)

為了進(jìn)一步確定BSA的猝滅機(jī)制， 測(cè)定蛋白質(zhì)的熒光壽命被測(cè)定。 平均熒光壽命可通過式(2)求出[4]

(2)

式(2)中， 〈τ〉為平均熒光壽命，A1和A2為雙指數(shù)衰減曲線中的振幅，τ1和τ2為相應(yīng)的衰減時(shí)間常數(shù)。 圖2(c)為BSA-SAB體系的瞬態(tài)熒光壽命曲線， 擬合得到的熒光衰減參數(shù)見表2。 從表2中可知， 隨著SAB濃度的增加， BSA的平均熒光壽命逐漸降低， 故可推測(cè)猝滅過程不是單純的靜態(tài)猝滅， 因?yàn)閱我坏撵o態(tài)猝滅是不會(huì)改變體系的熒光壽命， 也說明蛋白熒光基團(tuán)(色氨酸和酪氨酸殘基)的微環(huán)境發(fā)生了改變。 圖2(d)是BSA的熒光壽命比/熒光強(qiáng)度比與SAB濃度的關(guān)系。 從圖中可看出， 〈τ0〉/〈τ〉與濃度的曲線遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Stern-Volmer曲線， 說明靜態(tài)猝滅在整個(gè)蛋白熒光猝滅中占據(jù)主要的地位。 根據(jù)公式F0/F=(〈τ0〉/〈τ〉)(1/f)可計(jì)算得到激發(fā)態(tài)分子非靜態(tài)的比重f[8]。 對(duì)于BSA-SAB體系，f值為8.15%， 即靜態(tài)猝滅在BSA熒光猝滅中占的比重為91.85%， 故表明靜態(tài)猝滅是主要的猝滅方式。 綜上所述， 可以得出SAB導(dǎo)致BSA熒光猝滅的方式是以靜態(tài)猝滅為主的聯(lián)合猝滅方式。

表2 BSA-丹酚酸B體系的熒光壽命參數(shù)

2.1.2 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

蛋白質(zhì)與小分子的相互作用過程， 假設(shè)蛋白上存在n個(gè)等同的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)， 則結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可由Scatchard方程求出[9]

r/Df=nK-rK

(3)

式(3)中，r是每摩爾蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物摩爾數(shù)，Df是游離藥物的濃度，K和n分別是平衡結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。 根據(jù)線性方程的截距和斜率， 計(jì)算出K和n值， 結(jié)果見表1。 由表可知， BSA與SAB結(jié)合可形成1∶1型的復(fù)合物。 結(jié)合常數(shù)K的數(shù)量級(jí)在105， 且隨著溫度的升高逐漸減小， 說明結(jié)合力適中， 復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度升高而減弱。

2.2 SAB在BSA上結(jié)合位點(diǎn)分析

血清白蛋白能夠與許多小分子結(jié)合。 研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白能夠在三個(gè)區(qū)域(Site Ⅰ， Site Ⅱ和Site Ⅲ)與小分子發(fā)生結(jié)合。 現(xiàn)在已確定這三個(gè)位點(diǎn)的特異性配體： 華法林主要結(jié)合在Site Ⅰ； 布洛芬結(jié)合在Site Ⅱ； 洋地黃毒苷結(jié)合位點(diǎn)為Site Ⅲ[9]。 在位點(diǎn)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中， 可通過加入不同類型的位點(diǎn)標(biāo)記物， 分析位點(diǎn)標(biāo)記物對(duì)小分子與蛋白相互作用的影響， 進(jìn)而判斷出小分子的結(jié)合部位。

根據(jù)Sudlow提出的方法[4]， 以標(biāo)記物取代百分?jǐn)?shù)F2/F1×100對(duì)標(biāo)記物與蛋白的摩爾濃度比[Probe]/[Protein]作圖。 從圖3(a)可見， 熒光強(qiáng)度隨著華法林濃度的增加而不斷降低， 而布洛芬和洋地黃毒苷的加入， 對(duì)體系的熒光影響不明顯， 說明華法林與SAB發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)， 即SAB在BSA上的結(jié)合位置是亞結(jié)構(gòu)域ⅡA(Site Ⅰ)。

圖3 位點(diǎn)探針對(duì)BSA-丹酚酸B體系熒光強(qiáng)度的影響(a)和BSA-丹酚酸B體系熒光滴定曲線圖(b)

為確定色氨酸和酪氨酸殘基在相互作用過程中是否直接參與反應(yīng)， 測(cè)定BSA在不同激發(fā)波長(zhǎng)(280和295 nm)的熒光光譜。 當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)， 蛋白的熒光來自于色氨酸和酪氨酸殘基； 而在295 nm激發(fā)下， 僅僅只有色氨酸殘基才發(fā)射熒光[4]。 從圖3(b)可見， 在兩種激發(fā)波長(zhǎng)下BSA的熒光猝滅曲線基本上重疊， 表明酪氨酸殘基不參與熒光猝滅， 即蛋白的熒光僅來自于色氨酸殘基。 BSA中只含有兩個(gè)色氨酸殘基Trp-134和Trp-213， 其中Trp-134位于蛋白分子的表面， 處于親水環(huán)境中， 熒光強(qiáng)度常被水分子猝滅， 而Trp-213位于BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA的疏水空腔中。 因此， 蛋白的內(nèi)源熒光主要來源Trp-213殘基。 故可間接說明SAB主要在BSA的亞結(jié)構(gòu)域ⅡA處結(jié)合。

2.3 SAB對(duì)BSA構(gòu)象的影響

2.3.1 三維熒光光譜

圖4(a)和(b)為SAB加入前后BSA的三維熒光光譜圖。 從圖可見， 每個(gè)三維光譜圖都有4個(gè)峰， 其中像“山脊”的兩個(gè)峰分別為瑞利散射峰Peak a(λem=λex)和二階瑞利散射峰Peak b(λem=2λex)。 另外兩個(gè)典型的峰為Peak 1和Peak 2(反映色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為)[10]。 加入SAB后， BSA-SAB體系的Peak a峰強(qiáng)度增加(由161.5升至238.3)， 這可能是由于BSA-SAB復(fù)合物的形成導(dǎo)致體系中顆粒的粒徑增大， 散射效應(yīng)增強(qiáng)造成的[10]。 而Peak 1和Peak 2的熒光強(qiáng)度均降低(Peak 1降低45%； Peak 2降低48%)且峰位置發(fā)生了紅移(Peak 1從347 nm紅移到350.5 nm； Peak 2從347 nm紅移到349 nm)， 表明SAB的加入導(dǎo)致BSA的色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境(疏水性減小， 極性增加)發(fā)生變化。

圖4 BSA(a)與BSA-丹酚酸B體系(b)的三維熒光光譜圖

2.3.2 圓二色譜

圖5(a)是BSA-SAB體系的遠(yuǎn)紫外CD光譜圖。 單純的BSA以及與不同濃度SAB作用后BSA在208和222 nm附近都有兩個(gè)明顯的負(fù)特征峰(cotton效應(yīng))， 此為典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)特征[12]。 隨著SAB的加入， 結(jié)合小分子的BSA的遠(yuǎn)紫外CD光譜只發(fā)生很微小的改變， 特別是兩個(gè)特征峰的形狀及峰位置未發(fā)生明顯的變化， 表明BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量幾乎沒有變化， 仍然以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。 其中， α-螺旋結(jié)構(gòu)含量可由式(4)和式(5)計(jì)算[12]

(4)

(5)

式中， cp為BSA的摩爾濃度，n為BSA氨基酸殘基數(shù)，l為樣品池的厚度， MRE208是BSA在208 nm處的平均殘基橢圓率。 計(jì)算結(jié)果表明， 加入SAB后， BSA的α-螺旋含量從53.41%降到52.52%。 表明SAB結(jié)合BSA后基本上不會(huì)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。

圖5(b)為加入不同濃度的SAB后BSA的近紫外CD光譜圖。 在262和268 nm附近的兩個(gè)負(fù)峰以及290 nm處的肩峰， 對(duì)映著蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基以及二硫鍵微環(huán)境的變化[4]。 由圖可見， 隨著SAB的加入， BSA近紫外CD圖譜中這三個(gè)峰的改變非常小， 表明SAB的加入不會(huì)使BSA的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化。

圖5 pH 7.4時(shí)BSA-丹酚酸B體系的遠(yuǎn)紫外圓二色圖(a)和近紫外圓二色圖(b)

2.4 SAB核磁共振波譜

核磁共振波譜方法由于具有非侵入性、 無損性且不影響結(jié)合反應(yīng)的平衡等優(yōu)點(diǎn)， 在蛋白質(zhì)與小分子相互作用方面受到越來越多的關(guān)注。 本研究中， 以觀測(cè)SAB核磁信號(hào)為基礎(chǔ)， 研究BSA與SAB的結(jié)合機(jī)制。 圖6為SAB與BSA相互作用的1H NMR譜圖。 從圖可見， 當(dāng)SAB與BSA的摩爾比為10∶1(紅線)時(shí)， 由于BSA溶液的粘度太大， 使SAB的核磁譜圖中峰變寬以至于不能區(qū)分， 出現(xiàn)變寬效應(yīng)[13]， 故在以下分析中不再考慮。 當(dāng)它們的摩爾比為100∶1時(shí)， 化學(xué)位移發(fā)生改變， 質(zhì)子信號(hào)變寬， 一些尖峰合并， 表明BSA與SAB發(fā)生相互作用。 特別是H5”， H6”和H8的化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)， 說明H5”和H6”所在的苯環(huán)與BSA的芳香族氨基酸發(fā)生π—π相互作用， 而其他氫質(zhì)子的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)， 是由復(fù)合物形成過程中的磁去屏蔽效應(yīng)造成的[8]。 因此， 在SAB與BSA結(jié)合過程中， H5”和H6”所在的苯環(huán)發(fā)揮著重要的作用。 此外， 苯環(huán)是SAB上的主要疏水性基團(tuán)， 而苯環(huán)在兩者相互作用中發(fā)揮著重要作用， 故可以判斷BSA與SAB之間存在著較強(qiáng)的疏水作用力。

圖6 BSA與丹酚酸B相互作用的1H NMR譜圖

3 結(jié) 論

利用熒光光譜、 圓二色光譜和核磁共振波譜法等技術(shù)研究了BSA與SAB之間的結(jié)合機(jī)制。 結(jié)果表明， SAB能夠明顯地猝滅BSA的內(nèi)源熒光， 猝滅機(jī)制為以靜態(tài)猝滅為主的聯(lián)合猝滅。 SAB在BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA的疏水腔(Site Ⅰ)中與其發(fā)生相互作用， 形成1∶1的復(fù)合物。 三維熒光光譜和圓二色光譜結(jié)果表明， SAB的加入不會(huì)使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化， 但會(huì)使色氨酸和酪氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生改變。 此外， H5”和H6”所在的苯環(huán)在BSA與SAB結(jié)合反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。 本研究有助于了解活性小分子與生物大分子之間相互作用的本質(zhì)， 也為藥物篩選和臨床用藥提供一定的參考。