王金爽， 付瑩瑩， 符珉瑞， 高 斌*， 鄭大威， 常 宇

1. 北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部， 北京 100124 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 浙江 杭州 310003

引 言

血液損傷狀況是評價人工心臟泵設(shè)計是否可用的一個重要指標(biāo)， 血細(xì)胞在人工心臟泵葉輪轉(zhuǎn)動過程中產(chǎn)生的剪切應(yīng)力的作用下受到損傷， 導(dǎo)致其耐受性降低、 壽命下降[1-3]。 當(dāng)細(xì)胞受損傷達(dá)到細(xì)胞可承受的閾值后， 紅細(xì)胞破裂， 細(xì)胞內(nèi)部的血紅蛋白外泄， 即發(fā)生溶血。 目前評價血液損傷仍然采用測量游離血紅蛋白的方法， 只考慮完全破裂的紅細(xì)胞。 而事實上完全破裂產(chǎn)生溶血的紅細(xì)胞只占一小部分， 未破裂的紅細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)也受到了不同程度的不可逆損傷， 這種現(xiàn)象被稱作紅細(xì)胞的亞損傷[4]。 Horobin[5]、 Michael[6]研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞暴露在超生理的剪應(yīng)力下(50 pa以上)時， 雖然未破裂但其形變能力已經(jīng)受損。 因此在評價血液損傷時需要關(guān)注紅細(xì)胞亞損傷狀況， 對于紅細(xì)胞亞損傷還需要更多的研究。

目前也有一些學(xué)者從不同角度對紅細(xì)胞亞損傷情況進(jìn)行了研究， 例如， 設(shè)置機(jī)械敏感性指數(shù)以確定亞溶血閾值[7]； 通過紅細(xì)胞機(jī)械脆性、 血漿游離血紅蛋白等多種參數(shù)綜合來評價血液損傷[8]。 但現(xiàn)有的研究存在計算困難， 方法復(fù)雜等問題。

拉曼檢測技術(shù)可實現(xiàn)快速、 無損、 定量的檢測， 其光譜具備指紋光譜特征能夠真實的反映物質(zhì)的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)信息， 在評估細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能的損傷方面得到了廣泛的應(yīng)用[9]。 但是能否用于評估紅細(xì)胞的亞損傷尚不清楚。 因此本文開展體外血液剪切應(yīng)力實驗， 驗證拉曼光譜對紅細(xì)胞亞損傷程度的評估能力。

本研究將拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用到人工心臟泵領(lǐng)域可以更加細(xì)致的分析人工心臟泵磨損后的血液亞損傷狀況。 利用共聚焦拉曼儀器， 測量了0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa剪切應(yīng)力作用下的紅細(xì)胞拉曼譜圖， 通過對比紅細(xì)胞的拉曼譜圖變化， 評估紅細(xì)胞亞損傷的程度， 為建立更加全面的人工心臟泵血液損傷評價體系提供參考。

1 實驗部分

inVia共聚焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw公司)， TG-16WS高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司)， 血液剪切力試驗平臺(課題組搭建)； 實驗用豬血(北京實創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地)， Amresco 血紅蛋白標(biāo)樣(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)， HyClone 磷酸鹽緩沖溶液( PH7.4)(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)。

血液剪切力試驗平臺[10]主要由微控注射泵、 聯(lián)通管路和剪切力模擬裝置組成。 剪切力模擬裝置內(nèi)部為圓柱形轉(zhuǎn)子， 外部為同軸心的筒型圓柱定子， 試樣從轉(zhuǎn)子和定子之間0.1 mm的縫隙內(nèi)流過， 通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動速度對試樣施加不同大小的剪切力。 本實驗中， 通過試驗平臺分別對測試血樣施加暴露時間(微控注射泵控制試樣流過剪切模擬裝置的時間)為1 s， 大小分別為0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa的剪切力。

紅細(xì)胞懸液配制： 將1.5 mL磨損后的血液樣本以1 600 r·min-1離心5 min； 去除上層清液后加入3倍以上體積的PBS， 用移液槍吹散細(xì)胞(重復(fù)以上步驟， 洗滌紅細(xì)胞3次)； 取出50 μL的下層紅細(xì)胞， 用PBS稀釋至5 mL后混勻備用。 血紅蛋白溶液(稀釋法)配制： 稱取血紅蛋白粉末后， 將血紅蛋白粉末用超純水進(jìn)行溶解， 配置成100 mg·L-1濃度的血紅蛋白溶液。 血紅蛋白溶液(溶脹法)配制： 取150 μL的底層紅細(xì)胞， 加超純水稀釋至1.5 mL， 以15 000 r·min-1離心35 min， 上層清透溶液即為血紅蛋白溶液。

實驗采用100倍長焦物鏡， 532 nm激光光源波長， 積分時間為10 s， 積分次數(shù)為2次， 測量功率2.5 mW， 掃描范圍500～1 800 cm-1。 取樣本溶液10 μL滴至載玻片， 置于共聚焦拉曼顯微鏡載物臺上直接測量， 對每一樣本溶液進(jìn)行不少于20次的采集。 實驗用WIRE4.0對測量后的原始譜圖進(jìn)行基線校正、 平滑降噪的預(yù)處理。 Origin8.0對譜圖歸一化處理后取平均值， 根據(jù)紅細(xì)胞的拉曼譜圖對比， 評估紅細(xì)胞亞損傷的程度， 運(yùn)用曲線擬合方法對剪切應(yīng)力下紅細(xì)胞的特征峰進(jìn)行擬合， 驗證拉曼光譜對紅細(xì)胞亞損傷程度的評估能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅細(xì)胞與血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)譜圖及特征峰

實驗測定了相同條件下紅細(xì)胞與血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)譜圖， 對比如圖1所示， 其中血紅蛋白溶液(稀釋法)要比直接測量血紅蛋白粉末測得的峰位置信息更加豐富。 測量紅細(xì)胞譜圖與血紅蛋白溶液(溶脹法)測得的游離血紅蛋白峰位置、 峰強(qiáng)幾乎一致， 且比血紅蛋白溶液(稀釋法)和血紅蛋白粉末的峰位置信息更加精細(xì)、 豐富、 精確度高， 表現(xiàn)為1 549和1 604 cm-1兩位置的特征峰。 圖1中所標(biāo)注的峰位置皆為血紅蛋白特征峰， 峰的歸屬列出如表1所示。 1 549 cm-1峰位置歸屬與1 562 cm-1一致， 1 604 cm-1峰位置歸屬與1 586 cm-1一致。 對紅細(xì)胞懸液樣本在同樣的采集條件下重復(fù)采集， 經(jīng)預(yù)處理后的譜圖如圖2所示， 紅細(xì)胞特征峰表現(xiàn)穩(wěn)定。 紅細(xì)胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 且以本方法采集紅細(xì)胞譜圖方法正確、 重復(fù)性好。

圖1 紅細(xì)胞和血紅蛋白拉曼標(biāo)準(zhǔn)譜圖對比

圖2 紅細(xì)胞懸液拉曼譜圖重復(fù)采集結(jié)果

表1 532 nm紅細(xì)胞譜圖特征峰歸屬表[11-14]

2.2 共聚焦顯微拉曼測定不同剪切力下的紅細(xì)胞

2.2.1 不同剪切力紅細(xì)胞譜圖對比與分析

由圖3看出， 相同批次的血液樣本， 測量游離血紅蛋白吸光度為0.066， 對不同剪切力作用下紅細(xì)胞懸液樣本采集的譜圖有明顯差異。 1 280～1 680 cm-1區(qū)間放大如圖4所示， 隨著剪切力的增大， 1 376 cm-1峰位置左側(cè)明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1峰的強(qiáng)度升高， 1 639 cm-1峰的強(qiáng)下降。 1 300～1 500 cm-1的譜帶強(qiáng)度主要由吡咯環(huán)呼吸振動引起， 尤其1 376 cm-1峰位置對氧化態(tài)敏感， 此處的降低標(biāo)志著血紅素凝集[14]， 由左側(cè)的抬高可以看出血紅蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。 1 500～1 600 cm-1為亞鐵離子高自旋標(biāo)記帶， 1 549和1 604 cm-1峰的強(qiáng)度升高， 亞鐵離子脫氧高自旋[11]， 血紅蛋白向去氧態(tài)發(fā)展， 難以與氧結(jié)合。 1 638 cm-1位置為氧濃度的標(biāo)記帶， 表征α螺旋結(jié)構(gòu)[12]， 且對卟啉環(huán)氧化作用敏感， 此處減小說明α鏈合成減弱， 血紅蛋白不易與氧結(jié)合。

圖3 不同剪切力下紅細(xì)胞拉曼譜圖對比

圖4 1 280～1 680 cm-1不同剪切力下紅細(xì)胞拉曼譜圖對比

2.2.2 不同剪切力紅細(xì)胞譜圖的統(tǒng)計學(xué)分析

在測量功率2.5 mW、 積分時間10 s、 積分次數(shù)2次的條件下對每一溶液樣本進(jìn)行20次的測量采集， 經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)不同剪切力的作用下， 1 549 cm-1位置的ν11亞鐵離子高自旋振動標(biāo)記帶的峰強(qiáng)差異最明顯。 圖5給出了不同剪切力下1 549 cm-1位置峰強(qiáng)的散點圖， 說明不同剪切力下亞損傷紅細(xì)胞的譜圖采集穩(wěn)定性較好， 誤差較小。 剔除個別離散點后取平均， 對不同剪切應(yīng)力下1 549 cm-1位置峰強(qiáng)進(jìn)行擬合， 擬合發(fā)現(xiàn)線性擬合效果最好， 結(jié)果如圖6所示， 在1 549 cm-1位置， 剪切力大小與拉曼峰強(qiáng)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖5 1 549 cm-1位置不同剪切應(yīng)力的散點圖

圖6 不同剪切應(yīng)力與1 549 cm-1位置峰強(qiáng)擬合結(jié)果

2.3 重復(fù)性實驗驗證與分析

對不同批次的血液， 測量游離血紅蛋白吸光度為0.110， 進(jìn)行了不同剪切力下紅細(xì)胞的拉曼譜圖采集的重復(fù)性實驗， 檢測結(jié)果如圖7所示， 隨著剪切應(yīng)力的增大， 除了1 376 cm-1峰位置左側(cè)明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰強(qiáng)升高， 1 638 cm-1位置峰強(qiáng)下降以外， 在998和1 173 cm-1位置， 峰強(qiáng)也有增高的趨勢。 同樣對1 549 cm-1位置的峰強(qiáng)進(jìn)行擬合， 擬合結(jié)果如圖8所示， 說明在1 549 cm-1位置， 剪切力大小與拉曼強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖7 重復(fù)實驗中不同剪切力下紅細(xì)胞拉曼譜圖對比

圖8 重復(fù)實驗中不同剪切應(yīng)力與1 549 cm-1 位置峰強(qiáng)的線性擬合

對比兩組實驗結(jié)果， 可以看出雖然1 549 cm-1峰的強(qiáng)度與剪切應(yīng)力之間都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 且誤差小區(qū)分明顯， 但兩次實驗的擬合曲線k值有所差別。 倒置顯微鏡下觀察兩組血液樣本的紅細(xì)胞形態(tài)大部分完好， 幾乎無差別， 經(jīng)過分光光度法測量， 兩批血樣的游離血紅蛋白含量不同。 猜測擬合曲線的k值的不同可能是由于不同批次的血液樣本質(zhì)量、 紅細(xì)胞的耐受程度不同導(dǎo)致的， 這部分后續(xù)將做深入探究。 所以利用拉曼光譜法不僅可以簡單的區(qū)分不同剪切力條件下的血樣， 也可以很好的評價血液樣本的質(zhì)量， 尤其是在分光光度計測量溶血指標(biāo)變化不大、 光鏡觀察紅細(xì)胞形態(tài)幾乎無差別的情況下， 拉曼則有可能檢測到紅細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)更細(xì)微的變化， 可以更精確的鑒定紅細(xì)胞的損傷程度。

另外， 根據(jù)對紅細(xì)胞與血紅蛋白標(biāo)譜的對比結(jié)果， 紅細(xì)胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 不同剪切力的作用下， 紅細(xì)胞的拉曼譜圖變化體現(xiàn)其血紅蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化， 說明剪切力可以透過細(xì)胞膜對紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白產(chǎn)生影響。 在細(xì)胞膜未破裂的情況下， 剪切力的作用會導(dǎo)致處于1 639 cm-1位置的氧濃度標(biāo)記帶減弱， 這與G. Rusciano[13]的研究結(jié)果是一致的。 1 549和1 604 cm-1處的吸收峰峰強(qiáng)升高， 亞鐵離子脫氧高自旋， 導(dǎo)致血紅素與吡咯環(huán)之間的距離減小， 紅細(xì)胞直徑減小[4]。 考慮可能存在胞漿的流出導(dǎo)致血紅蛋白濃度相對增加[4, 15]， 細(xì)胞內(nèi)粘度增加， 使得細(xì)胞直徑的減小， 從而影響到血紅蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 但具體剪切應(yīng)力是如何透過細(xì)胞膜而影響到其內(nèi)部血紅蛋白結(jié)構(gòu)的機(jī)制還有待探討。

3 結(jié) 論

實驗測定不同剪切力下紅細(xì)胞的拉曼譜圖， 結(jié)果顯示1 376 cm-1峰位置左側(cè)譜線明顯抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰強(qiáng)隨著剪切力的增大升高， 1 639 cm-1位置峰強(qiáng)則減弱。 其中1 549 cm-1位置峰強(qiáng)為亞鐵離子高自旋帶， 與β鏈螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)， 在不同剪切力的作用下， 峰強(qiáng)差異表現(xiàn)最明顯。 經(jīng)曲線擬合， 發(fā)現(xiàn)此位置紅細(xì)胞的峰強(qiáng)與剪切應(yīng)力呈明顯的正向線性關(guān)系， 線性擬合效果良好。 經(jīng)過重復(fù)性實驗驗證， 證明該方法且具有較好的重現(xiàn)性。 另外根據(jù)不同剪切力作用導(dǎo)致紅細(xì)胞拉曼譜圖的變化， 而紅細(xì)胞譜圖能夠反映血紅蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 說明剪切應(yīng)力可以透過細(xì)胞膜而影響到其內(nèi)部血紅蛋白結(jié)構(gòu)。 利用拉曼技術(shù)可以準(zhǔn)確、 快速的區(qū)分在不同剪切應(yīng)力下受到不同程度損傷的紅細(xì)胞， 并能根據(jù)譜圖推論分析細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化， 樣本處理簡單、 耗時短、 操作簡便。 未來可以嘗試定量分析， 建立更加全面的紅細(xì)胞損傷評價體系， 進(jìn)一步拓寬拉曼檢測方法在人工心臟泵血液損傷評價方面的應(yīng)用。