諶愛華，蔣 冰，王妙華，吳嘉萍，楊雨婷，賀福元,2△，鄧凱文,3△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，是由各種原因造成局部腦組織血液供應(yīng)障礙，引發(fā)的腦組織缺血缺氧性壞死，如不經(jīng)及時治療，對患者的生活質(zhì)量及生活自理能力產(chǎn)生極大影響，且有較高的致殘、致死和復(fù)發(fā)風(fēng)險。我國每年新發(fā)腦卒中人數(shù)逐漸增多，速率增長迅速，遠高于全球平均水平[1]。腦缺血后神經(jīng)元損傷一旦超過治療時間窗，就無法自然修復(fù)，造成嚴(yán)重后果，故探討其發(fā)病機制及有效防治措施，是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重點。針刺治療缺血性腦卒中療效顯著，但其治病機制尚未完全闡明[2]。隨著現(xiàn)代生物分子網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展及各學(xué)科的交叉滲透，基于“網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)”“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”的發(fā)展，“網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)”也應(yīng)運而生，常規(guī)的關(guān)于針刺效應(yīng)機制的研究多為單一因素的研究，對于最終效應(yīng)產(chǎn)生的各個過程的研究十分匱乏，且對于各個環(huán)節(jié)之間的相互影響、相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系了解甚少，缺乏系統(tǒng)的研究和規(guī)律的提煉，也未與其他學(xué)科相交流，對于針灸現(xiàn)代化的研究推動作用較小。網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)[3]是在“疾病-穴位-基因-靶點”相互作用關(guān)系基礎(chǔ)上，與邊緣學(xué)科相互融合，運用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析手段，研究穴位的配伍及產(chǎn)生效果的生物學(xué)機制，其研究重點是在可視化生物分子網(wǎng)絡(luò)中反映穴位效應(yīng)、病證的關(guān)系，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)觀察穴位對疾病的干預(yù)和影響，發(fā)現(xiàn)腧穴配伍的功能和作用機制。郭義教授[4]指出，針刺效應(yīng)的產(chǎn)生是針刺啟動穴位局部“穴網(wǎng)絡(luò)”，從而調(diào)節(jié)機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫大網(wǎng)絡(luò)，最終作用于靶器官“病網(wǎng)絡(luò)”，至于如何從“小網(wǎng)絡(luò)”影響到“大網(wǎng)絡(luò)”，其過程十分繁雜，只有將各個部分建立相互聯(lián)系、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型，才能解決針灸作用規(guī)律。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)方法，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)建立穴位、靶點及缺血性腦卒中之間的關(guān)系，探究針刺治療缺血性腦卒中的有效穴位及主要作用機制。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

檢索中國知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫和維普中文期刊數(shù)據(jù)庫中的文獻。檢索時限：2009年7月—2019年7月。檢索方式：主題詞檢索。檢索詞：“針刺”“針灸”+“腦缺血”“缺血性腦卒中”“缺血性卒中”“腦梗死”“腦梗塞”“腦栓塞”“缺血性中風(fēng)”“MCAO”“大腦中動脈缺血”“大腦中動脈栓塞”“大腦中動脈阻塞”“大腦中動脈梗阻”“大腦中動脈閉塞”。

1.2 文獻納入標(biāo)準(zhǔn)

①以毫針或電針治療腦缺血的實驗研究文獻；②與分子機制相關(guān)的動物實驗研究；③碩博士論文中關(guān)于動物實驗分子機制方面的研究；④腦缺血再灌注；⑤文獻所選取腧穴有具體定位及歸經(jīng)。

1.3 文獻排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并其他方法治療腦缺血的文獻；②腦缺血合并其他疾病的文獻；③無具體腧穴定位及歸經(jīng)的文獻；④臨床研究、系統(tǒng)評價、Meta分析和綜述類文獻；⑤會議論文；⑥除外耳穴、眼針等療法；⑦重復(fù)文獻(保留發(fā)表文獻最近的1篇)。

1.4 建立數(shù)據(jù)庫

對篩選、納入的文獻進行整理，數(shù)據(jù)錄入到Excel電子表格保存，根據(jù)穴位、穴位歸經(jīng)、靶點名稱、針刺效應(yīng)和文獻來源等進行分類整理。參考《經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)》，對穴位名稱與歸經(jīng)進行規(guī)范化處理。將符合要求的數(shù)據(jù)建立針刺治療缺血性腦卒中的“經(jīng)脈-穴位-靶點數(shù)據(jù)庫”。

1.5 分析軟件及數(shù)據(jù)庫

Cytoscape 3.6.1軟件；DAVID數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 頻次分析

通過上述檢索方式及參照納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻有437篇，共涉及腧穴65個，取穴頻次最多的為百會穴，達278次；屬于特定穴的腧穴有51個，使用最多的特定穴為五輸穴，共21個，其次為交會穴，共19個；督脈選用頻次最高，共686次，選用穴位數(shù)量最多的經(jīng)脈為足少陽膽經(jīng)，共計11個腧穴；文獻中共涉及靶點371個，其中TNF-ɑ及GFAP使用頻次最多，各24次。

2.2 經(jīng)脈-穴位-靶點網(wǎng)絡(luò)

Cytoscape3.6.1軟件為一種能將網(wǎng)絡(luò)可視化，并能進行分析的系統(tǒng)軟件，可通過生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化的形式將高通量基因表達數(shù)據(jù)、分子狀態(tài)信息有機整合在一起，將其用節(jié)點與邊的形式表現(xiàn)出來，便于較直觀地觀察網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系。用該軟件構(gòu)建經(jīng)脈-穴位-靶點網(wǎng)絡(luò)，通過network analyzer分析穴位與靶點之間的網(wǎng)絡(luò)特征，計算節(jié)點的度值(degree)及中介中心性(betweenness)，觀察針刺穴位與缺血性腦卒中靶點的關(guān)聯(lián)情況，評價穴位及靶點的拓?fù)湎嚓P(guān)性。缺血性腦卒中經(jīng)脈-穴位-靶點網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。

注:藍色代表經(jīng)脈，紅色代表穴位，綠色代表靶點。

2.3 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)屬性

本網(wǎng)絡(luò)中共涉及450個節(jié)點，包括371個靶點，腧穴65個，經(jīng)脈14條,如表1～2所示。節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連路線的條數(shù)，度值越大，其相關(guān)性越高。

2.4 關(guān)鍵靶點的選擇

將表1中的371個靶點的度值進行降序排列，并計算所有靶點的累計百分比，選取計算結(jié)果≥70%的臨界靶點及其之前的靶點，共計149個，將該149個靶點與樊啟猛等[5]人研究的與缺血性腦卒中緊密相關(guān)的46個靶點進行重合，篩選出相同靶點，相同的靶點代表針刺治療缺血性腦卒中的有效靶點，重合后共計有18個靶點，分別為TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin；同時按上述方法計算65個穴位度值的累計百分比，選取累計百分比≥60%的臨界穴位及之前的穴位，共計8個，分別為百會、水溝、足三里、內(nèi)關(guān)、曲池、大椎、合谷及神庭。

表1 與針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的靶點(按度值大小排序)

表2 針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的穴位(按度值大小排序)

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫為生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大量基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，常用的主要有g(shù)ene ID的轉(zhuǎn)換、差異基因的功能注釋和通路富集分析。用該數(shù)據(jù)庫對上述18個關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO富集分析共收集到170條相關(guān)結(jié)果，根據(jù)P<0.000 01，有8條符合要求,如表3所示，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點基因功能信息主要富集于胚胎植入、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)磷酸化、激活MAPK活性、卵巢卵泡發(fā)育和對藥物的反應(yīng)等方面；KEGG信號通路顯示，針刺治療腦缺血靶點涉及的KEGG通路共有57條，根據(jù)P<0.000 01，發(fā)現(xiàn)靠前的通路主要有8條,如表4所示，分別與MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路、Pertussis、Tuberculosis及Chagas disease(American trypanosomiasis)等相關(guān)。

表3 針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點富集信息(P<0.000 01)

表4 針刺治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點通路信息(P<0.000 01)

3 討論

本研究基于文獻檢索，發(fā)現(xiàn)與針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的腧穴有65個，其中百會穴選用次數(shù)最多，達278次；屬于特定穴的腧穴有51個，使用最多的特定穴為五輸穴，共21個，督脈選用次數(shù)最多，達686次；足少陽膽經(jīng)選用腧穴數(shù)目最多，共11個；涉及靶點有371個，其中TNF-ɑ及GFAP使用頻次最多，各24次。通過構(gòu)建經(jīng)脈-穴位-靶點網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵穴位共計8個，分別為百會、水溝、足三里、內(nèi)關(guān)、曲池、大椎、合谷與神庭，主要涉及督脈、足陽明胃經(jīng)、手陽明大腸經(jīng)和手厥陰心包經(jīng)；其治療關(guān)鍵靶點共18個，分別為TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP-2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin。

缺血性腦卒中主要原因為腦血管閉塞不通、腦功能異常，從而導(dǎo)致神志障礙及肢體感覺、運動障礙。針刺治療時多選用頭局部穴位及患側(cè)肢體穴位。百會位于督脈，為足厥陰肝經(jīng)、六陽經(jīng)和督脈交會穴，可開竅醒神、平肝熄風(fēng)，能顯著降低大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀[6]。水溝亦屬督脈經(jīng)穴，為督脈與手足陽明經(jīng)之交會穴，可通督醒腦、開竅醒神，能有效抑制缺血側(cè)半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡及降低鈣離子濃度，減輕缺血缺氧所造成的損傷程度[7]。內(nèi)關(guān)屬手厥陰心包經(jīng)，為絡(luò)穴、八脈交會穴，通于陰維脈，可養(yǎng)心安神，能通過促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移來加速新血管的形成[8]。大椎位于督脈，為六陽經(jīng)與督脈交會穴，可調(diào)神通督、匡扶陽氣，改善腦缺血后的神經(jīng)功能障礙[9]。陽明經(jīng)穴在治療本病時優(yōu)勢明顯，手足陽明經(jīng)均為多氣多血之經(jīng)，治療本病時也常取此二經(jīng)穴位，足三里與曲池分屬足陽明胃經(jīng)與手陽明大腸經(jīng)的合穴，經(jīng)脈經(jīng)氣可通過合穴深入于臟腑，故針刺陽明經(jīng)之合穴，可補氣養(yǎng)血、平調(diào)臟腑功能，且研究顯示[10]，針刺曲池和足三里能促進腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，縮小腦部缺血區(qū)面積。合谷屬手陽明大腸經(jīng)，可疏風(fēng)舒筋、行氣活血，刺之可增加局部筋脈氣血的濡養(yǎng)，且可激活同側(cè)小腦后葉上半月小葉以及對側(cè)小腦后葉下半月小葉[11]。神庭屬督脈，為督脈與膀胱經(jīng)、胃經(jīng)之交會穴，可益智醒神開竅，明顯提高患者認(rèn)知功能[12]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性腦卒中發(fā)生的根本原因在于大腦供血動脈被栓子堵塞，缺血側(cè)腦組織因急性缺血缺氧而引發(fā)炎癥反應(yīng)、微血栓形成、腦細(xì)胞能量衰竭與缺氧去極化、自由基的毒性作用、Ca2+超載的細(xì)胞毒、興奮性氨基酸毒性損傷與細(xì)胞凋亡等一系列過程[13]。通過分析所得18個關(guān)鍵靶點中，TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ICAM-1及P38MAPK主要參與缺血后炎癥反應(yīng)，CASP3、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、AIF、ERK1與細(xì)胞壞死及凋亡相關(guān)，SOD、HO-1主要調(diào)控缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng)，P-selectin主要參與血栓形成，BDNF、TGF-β主要參與神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)，VEGFR2與血管新生關(guān)系密切。腦缺血發(fā)生后，包括TNF-α、IL在內(nèi)的炎癥因子大量表達，加重炎癥反應(yīng)；同時，體內(nèi)ICAM-1的表達上調(diào)，導(dǎo)致局部血管損傷、微循環(huán)血流動力學(xué)障礙[14]；氧自由基大量蓄積，且清除率低，可加重炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程，體內(nèi)SOD及HO-1能調(diào)控機體氧化與抗氧化平衡[15]；Bcl-2和Bax比例失衡，使大量促凋亡因子被釋放到胞質(zhì)中，從而和Caspase家族結(jié)合，啟動內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[16-17]；p38MAPK可參與多個過程，從不同方面對腦損傷產(chǎn)生影響[18]；ERK1/2信號通路可介導(dǎo)缺損傷后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的壞死及凋亡[19]；P-selectin在腦缺血缺氧發(fā)生后，可增加血小板聚集于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，對血流造成影響，促進血栓形成[20]。腦缺血后除產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損外，也啟動了機體自我保護和修復(fù)機制，如BDNF分泌增加，可促進神經(jīng)元再生、分化及修復(fù)[21]；缺血缺氧還可誘導(dǎo)VEGF表達增加，加速建立腦部側(cè)支循環(huán)，改善局部血供[22]。實驗研究顯示，針刺可降低腦缺血大鼠體內(nèi)的IL-1β、IL-6、NF-κB和IL-8含量，減輕與其相關(guān)的各種炎性細(xì)胞因子的表達，從而抵抗腦缺血[23]；還可增強腦缺血大鼠體內(nèi)SOD及HO-1的分泌，降低MDA含量，提高機體對氧自由基清除能力[23-26]；也能通過提高VEGF水平，加速腦缺血后新生血管形成[27]；還可增加BDNF含量來達到修復(fù)缺血后神經(jīng)損傷的目的[28]；通過上調(diào)MK、下調(diào)CASP3及介導(dǎo)ERK/JNK/P38信號通路來營養(yǎng)神經(jīng)，減少細(xì)胞凋亡[29-30]。

通過GO基因分析及KEGG富集通路分析，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點基因富集信息涉及170條，主要富集于胚胎植入、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)磷酸化、激活MAPK活性、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、卵巢卵泡發(fā)育和對藥物的反應(yīng)，針刺治療缺血性腦卒中的靶點富集通路有57條，主要與TNF signaling pathway、Pertussis、Tuberculosis、Chagas disease(American trypanosomiasis)、Proteoglycans in cancer、Malaria、Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)及NOD-like receptor signaling pathway等相關(guān)。通過以上分析，本研究預(yù)測針刺很可能通過P38MAPK、MMP-9、TNF-α、ERK-1、IL-1β、IL-6、CASP3及ICAM-1等關(guān)鍵靶點來調(diào)節(jié)TNF、NOD等信號通路，從而抑制炎癥反應(yīng)、減輕細(xì)胞凋亡等過程，達到治療腦缺血的目的。此外，某一個信號通路可能與多個疾病相關(guān)，也為針刺通過該信號通路治療其他相關(guān)疾病提供可能。

中醫(yī)整體觀念認(rèn)為人作為一個有機整體，針刺通過穴位刺激可調(diào)控整個人體網(wǎng)絡(luò)，可多靶點、多通路和多環(huán)節(jié)對缺血性腦卒中產(chǎn)生影響，而不是簡單的“針刺-效應(yīng)”兩點關(guān)系，其產(chǎn)生效應(yīng)也并不僅僅局限于實驗所得的數(shù)據(jù)中，許多未知的數(shù)據(jù)需要進一步研究，但目前研究多處于多個穴位對幾個靶點的影響作用上，未能系統(tǒng)、整體描述其治病機制，且對單穴治療缺血性腦卒中的靶點通路的研究也十分缺乏，筆者基于文獻研究，借助網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)方法，從網(wǎng)絡(luò)層次探究針刺治療缺血性腦卒中的生物學(xué)機制，對理解針刺對缺血性腦卒中靶點作用關(guān)系提供了重要信息，為進一步探究針刺治療缺血性腦卒中的基礎(chǔ)實驗研究提供理論依據(jù)。