莊星星，倪受東，陳明，苗仁華，張鵬，李萌

安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院 安徽巢湖 238000

細辛、干姜兩味中藥均首見于《神農本草經》 “細辛，味辛，性溫。主咳逆，頭痛，腦動，百節(jié)拘攣，風濕痹痛，死機”具有解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲的功效[1]?！案山?，味辛，性溫。主胸滿，咳逆上氣，溫中止血，出汗，通神明，生川谷”具有溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲的功效[2]?！凹毿?干姜”藥對配伍最早見于漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的小青龍湯。細辛溫中下氣，破痰利水道，干姜溫通上焦心肺，兩藥配伍達到溫肺化飲的功效[3]。《中藥方劑數據庫》中檢索出含“細辛-干姜”藥對的方劑約273首，臨床主治癥廣泛，其中以呼吸系統(tǒng)的疾病，如咳喘、痰飲以及風寒感冒最為多見[4]。

藥理學研究表明“細辛-干姜”藥對可有效降低COPD大鼠血清TNF-a和IL-8 含量，升高 IL-2 含量，改善肺功能，減輕氣道炎癥，延緩或打斷 COPD 的發(fā)展，藥對藥效優(yōu)于單味中藥[5]。網絡藥理學研究也表明細辛、干姜兩藥配伍使用具有協(xié)同作用，隱亭、芝麻脂素和鄰苯二甲酸二丁脂可能是藥對功效機理發(fā)揮的重要物質基礎；前列腺素G/H合酶2、β2-腎上腺素能受體、促細胞分裂蛋白激酶2和熱激蛋白90可能是藥對活性成分發(fā)揮作用的潛在靶點[6]。

課題組前期研究和文獻資料調研的基礎上，以細辛中的主要活性成分細辛脂素、芝麻脂素[7]和干姜中的6-姜酚、6-姜烯酚[8]為指標，結合HPLC特征指紋圖譜，定量分析“細辛-干姜”藥對配伍前后藥材中指標成分的含量變化以及定性分析指紋圖譜變化，從化學層面探討藥對配伍的可能機理。

儀器與材料

1 儀器

1260 II高效液相色譜儀配置四元泵、VWD檢測器、OpenLAB工作站（美國 Agilent公司）；BT25S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；FA1204B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KMD-500調溫電熱套（金壇市鴻科儀器廠）；RE-52旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL16E高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；JK100B超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）。

2 材料

細辛脂素對照品（20mg/支，純度：99.70%，批號：DC-19080704）；芝麻脂素對照品（20mg/支，純度：99.75%，批號：DC-19111607）；6-姜酚對照品（20mg/支，純度：99.69%，批號：DC-19040810）6-姜烯酚對照品（20mg/支，純度：99.70%，批號：DC-19061204）購自南京滴純生物科技有限公司。細辛飲片和干姜飲片購自亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司，經安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院倪受東副主任中藥師鑒定分別為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag. 的干燥根和根莖和姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，藥材產地和批號見表1。

甲醇（色譜純，批號：20180302，天津基準化學試劑有限公司）；超純水由安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院檢驗科提供。

表1 藥材的產地和批號信息

方法和結果

1 供試液制備

稱取細辛、干姜各12.0 g，根據前期正交試驗優(yōu)選的最佳水提取工藝：浸泡浸泡1小時，加6倍量水（首煎考慮藥材吸水率，加水量為8倍），提取2 h，提取3次。所得提取液混合濃縮定容至50.0 mL 容量瓶中。細辛和干姜單煎液分別標記細辛S1-S10和干姜S1-S10，細辛-干姜混煎液標記混煎S1-S10。備用。

精密吸取濃縮液各10.0 mL 分別置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加75%甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜濾過，轉移至10.0 mL量瓶中，超聲30 min，冷卻后定容，備用。

2 對照品溶液制備

精密稱取細辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚適量，分別置于不同容量瓶中，甲醇溶解，制成濃度1.0 mg/mL的細辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚對照品溶液。

精密吸取濃度細辛脂素對照品溶液200μL、芝麻脂素對照品溶液100μL、6-姜酚對照品溶液200.00μL和6-姜烯酚對照品溶液200.00μL置于同一100mL容量瓶，甲醇定容，制成細辛脂素濃度2.00μg/mL、芝麻脂素濃度1.00μg/mL、6-姜酚濃度2.00μg/mL和6-姜烯酚濃度2.00μg/mL的混合對照品溶液。

3 指紋圖譜建立及分析

3.1 色 譜 條 件 Agilent EC-C18（4.6×150mm，4μm）；柱溫 30℃；檢測波長：205nm；流速：1.0mL/min；流動相為甲醇和水，洗脫程序：0～15min，25%甲醇；15 ～ 30min，25%~50% 甲醇；30 ～ 45min，50%甲 醇；45～ 46min，50% ～ 25% 甲 醇；46～ 50min，25%甲醇。進樣量：40μL。

3.2 精密度試驗 取“1”項下所得供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，建立指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》進行相似度評價。結果各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗 取“1”項下所得供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下分別于 0、1、2、4、8、16、24 h 依次進樣檢測，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》進行相似度評價。結果各共有峰相對保留時間及相對峰面積 RSD 均＜3%，表明24h 內供試品溶液的成分穩(wěn)定。

3.4 重復性試驗 取細辛、干姜各12.0 g，按“1供試液制備”方法平行制備供試品溶液6份，在“3.1”項色譜條件下進樣檢測。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》進行相似度評價。結果各共有峰相對保留時間及相對峰面積 RSD 均＜3%，表明重復性良好。

3.5 指紋圖譜的建立 將“1”項下所得供試液和“2”項下所得混合對照品溶液，在“3.1”項色譜條件下檢測，分別得到10批細辛單煎液、10批干姜單煎液、10批細辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜以及混合對照品指紋圖譜。將所得的指紋圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》多點校正，自動匹配生成對照圖譜?；旌蠈φ掌稨PLC圖譜、10批細辛單煎液、10批干姜單煎液以及10批細辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜見圖1-4。

3.6 配伍前后指紋圖譜的變化分析 建立10批細辛HPLC指紋圖譜，確定了9個共有峰。通過與混合對照品HPLC圖譜對比，確定6號峰為芝麻脂素，7號峰為細辛脂素，見圖2。建立10批干姜HPLC指紋圖譜，確定了13個共有峰。通過與混合對照品HPLC圖譜對比，確定8號峰為6-姜酚，11號峰為6-姜烯酚，見圖3。

建立10批細辛-干姜混煎液HPLC指紋圖譜（見圖4），確定了17個共有峰。通過與混合對照品HPLC圖譜對比，確定9號峰為6-姜酚，，12號峰為芝麻脂素，13號峰為細辛脂素，14號峰為6-姜烯酚。通過對比細辛、干姜單煎液和細辛-干姜混煎液的HPLC指紋圖譜，對藥對HPLC指紋圖譜確定的17個峰進行初步歸屬：3、7、11、12、16 號峰來源于細辛；1、2、4~6、8~10、14、15、17號峰來源于干姜。結果發(fā)現藥對共煎的過程中沒有含量較大的組方產生或消失。細辛、干姜單煎液HPLC指紋圖譜中部分面積較小的峰，在藥對共煎液的HPLC指紋圖譜中并未出現，可能是共煎過程中影響了該類成分的溶出，見圖4。

4 指標性成分含量測定

4.1 線性關系考察 按照“3.1”項下色譜條件，將“2”項下所得混合對照品溶液，甲醇稀釋至 0、2、4、8、16、32倍，制成系列混合對照品溶液，分別進樣40μL，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X，μg/mL）為橫坐標，得6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚的標準曲線方程及線性范圍。結果見表2。

圖1 對照品HPLC色譜圖

圖2 10批細辛藥材HPLC指紋圖譜

圖3 10批干姜藥材HPLC指紋圖譜

4.2 精密度試驗 取“2”項所得混合對照品溶液，在“3.1”項色譜條件下，連續(xù)進樣6次，記錄各指標性成分峰面積。結果6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為0.96%、1.09%、1.13%、1.32%，說明儀器精密度良好。

圖4 10批“細辛-干姜”藥對HPLC指紋圖譜

表2 各指標性成分的標準曲線方程、相關系數及線性范圍

4.3 穩(wěn)定性試驗 取“2”項下所得混合對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下，分別于 0、2、4、8、16、24 h 依次進樣。結果6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為0.36%、0.87%、0.92%、0.54%，說明混合對照品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

4.4 重復性試驗 取細辛、干姜各12.0 g，按“2.1”項方法，平行制備供試品溶液6份，在“2.3.1”項色譜條件下進樣檢測。結果結果6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚平均峰面積的RSD分別為2.31%、2.85%、3.06%、3.32%，說明方法重復性良好。

5 樣品含量測定

取“1”項下所得10批細辛單煎液、10批干姜單煎液、10批細辛-干姜混煎液，在“3.1”項色譜條件下進樣檢測。計算供試品溶液細辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚濃度。用SPSS17.0對不同組別間的濃度測定結果做統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有顯著性。

“細辛-干姜”藥對混煎中6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚的濃度較藥材單煎液中的濃度相當，說明細辛和干姜混煎過程中部分指標性成分的溶出度未見明顯變化。結果見表3。

討 論

中藥藥對研究是方劑研究的基礎，是闡明中醫(yī)遣藥組方機理的重要途徑。相比簡單單味中藥，藥對的配伍機理研究更能體現中醫(yī)的“藥”和“方”的科學內涵。中藥藥對的研究作為研究熱點，學者們通過研究中醫(yī)方劑中常見的中藥藥對，發(fā)現藥對的配伍機理主要體現在三個方面：一是化學成分變化，藥對經過配伍后，由于兩藥之間發(fā)生化學反應使得主要藥效成分的溶出率[9]發(fā)生變化，或者產生新的藥效成分[10]；二是藥動學改變，藥對經過配伍后，由于中藥成分復雜，各成分之間在體內發(fā)生相互作用或者影響體內主要代謝酶活性使得主要活性成分體內藥動學過程發(fā)生了改變[11-12]。三是藥理學變化，藥物配伍后由于化學成分間的相互作用，使得藥效學物質基礎發(fā)生改變，使得進入機體組織或者細胞后作用的靶點增多，通過不同生化通路起到協(xié)同作用從而增強藥理作用[13]。

表3 細辛、干姜配伍前后指標性成分的含量測定結果（，n=10）μg/mL

表3 細辛、干姜配伍前后指標性成分的含量測定結果（，n=10）μg/mL

樣品 細辛脂素 芝麻脂素 6-姜酚 6-姜烯酚細辛單煎液 0.1655±0.0069 0.1346±0.0136 － －干姜單煎液 － － 0.1148±0.0270 0.2522±0.798藥對混煎液 0.1768±0.0083 0.1388±0.0213 0.1238±0.0301 0.2368±0.1185

“細辛-干姜”藥對配伍前后的指紋圖譜變化進行分析，藥對指紋圖譜主要貢獻來自于干姜。細辛單煎液的HPLC指紋圖譜確定了9個共有峰，干姜單煎液的HPLC指紋圖譜確定了13個共有峰。藥對混煎液的HPLC指紋圖譜確定了17個共有峰，其中12個來源于干姜，5個來源于細辛，提示細辛和干姜在配伍后，多數特征成分的溶出度未見明顯變化。歸屬性分析提示藥對混煎液的HPLC指紋圖譜沒有新增的物質峰產生，說明藥材中的化學成分之間相對穩(wěn)定。藥對混煎液中的指標性成分6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚濃度和藥材單煎液中的濃度相當，說明在藥對混煎過程中，雖然各藥材中的化學成分相互影響，作為主要指標性成分的溶出度未見明顯變化，“細辛-干姜”藥對的配伍機理需要進一步研究。