吳倩 ，穆婷婷 ，汪寧

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230012

2 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230012

3 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥效與安全評(píng)價(jià)研究所，安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230012

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)等多種高級(jí)精神活動(dòng)[1]。同時(shí)，海馬也是腦組織中對(duì)低氧最敏感的區(qū)域，因此，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞適用于缺血性腦損傷模型的制備及研究[2]，但海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)過(guò)程較為復(fù)雜，細(xì)胞及其嬌嫩，培養(yǎng)過(guò)程可變因素較多，因此，進(jìn)一步優(yōu)化其培養(yǎng)過(guò)程，對(duì)于獲得純度較高生長(zhǎng)穩(wěn)定的海馬神經(jīng)元極為重要。本文通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的參考，并在實(shí)際操作中不斷摸索和改良，對(duì)海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，以期為腦缺血的體外研究提供更好的模型。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新生24h的SD大鼠，雌雄不限，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 L-多聚賴(lài)氨酸（7~15萬(wàn)單位），Sigma公司；胰蛋白酶消化液，碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清（FBS）、Neurobasal Medium培養(yǎng)基、B27（神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子），L-Glutaminne（谷氨酰胺），Gibco公司；PBS緩沖鹽；Map-2、Cy3熒光二抗等。

1.3 實(shí)驗(yàn)器具與儀器 手術(shù)器具：眼科剪（3把）、彎鑷（3把）、直鑷（1把）、紗布若干、培養(yǎng)皿（2個(gè)）、漏斗（2個(gè)）、玻璃吸管（2根）、青霉素瓶若干、15mL離心管若干，以上物品需提前高壓后使用；冰盒（-20℃）。

儀器：恒溫 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，倒置顯微鏡，熒光倒置顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)皿的處理 實(shí)驗(yàn)選用6孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用終濃度為0.1%的多聚賴(lài)氨酸，于培養(yǎng)箱進(jìn)行包被鋪板，約30min~1h，包被結(jié)束后回收多聚賴(lài)氨酸，用無(wú)菌PBS沖洗6孔板2遍，待用。

2.2 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

2.2.1 分離海馬組織 將出生24h的SD大鼠經(jīng)75%酒精消毒，剪開(kāi)顱骨，取出全腦組織，浸于盛有預(yù)冷PBS溶液的培養(yǎng)皿中，使用彎鑷去除小腦和腦干部分，然后分離左右兩半球，海馬位于半球的腹內(nèi)側(cè)，完整取出“新月形”海馬組織，輕輕去除粘連的腦組織和血管，并將剝離的海馬組織移入另一個(gè)干凈已預(yù)冷的PBS溶液培養(yǎng)皿中輕輕漂洗，再移至裝有2mL PBS的無(wú)菌青霉素瓶子中，用眼科剪快速剪碎呈1mm×1mm×1mm大小。

2.2.2 消化及離心 加入2mL濃度為0.25%胰蛋白酶，使其終濃度為0.125%，置于37℃溫箱中，消化約10～15min，每隔10min緩慢搖勻一次以充分消化。待組織呈粥糜狀時(shí)，加含10%血清的F12培養(yǎng)基4 mL終止消化，用玻璃吹管輕輕吹打組織團(tuán)塊，使其變成懸濁液，1000r/min，離心5min，棄上清。

2.2.3 細(xì)胞接種 加入接種培養(yǎng)基（含10%血清的DMEM/F12）重懸沉淀，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄當(dāng)前的細(xì)胞數(shù)目，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整細(xì)胞的密度。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2.4 細(xì)胞換液 第2d半量換為完全培養(yǎng)基：Neurobasal+B27培養(yǎng)基（含濃度為0.2mol/L-1的谷氨酰胺），后每2天換液（完全培養(yǎng)基）1次，生長(zhǎng)8d后，用于實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

2.3 海馬神經(jīng)元的觀察 倒置顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元在不同時(shí)間段的形態(tài)學(xué)變化并拍照，比較觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和突起的形成。

圖1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟

2.4 海馬神經(jīng)元的免疫熒光鑒定 從培養(yǎng)箱將培養(yǎng)至第8 d的海馬神經(jīng)元取出，吸去培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗細(xì)胞2遍，加入4 %多聚甲醛固定30min。固定結(jié)束后，用PBS輕輕漂洗3遍，置于搖床上慢速搖晃，每次漂洗10min，以棄去多余的多聚甲醛。封閉30 min，棄上清液，加入一抗（小鼠抗Map-2，小鼠抗Cy3），4 ℃過(guò)夜進(jìn)行孵育。第二天取出培養(yǎng)板（或皿），棄上清液，用PBS輕輕漂洗3次，漂洗時(shí)置于搖床上慢速搖晃，每次10min，結(jié)束后加入二抗，37 ℃孵育1 h，避光操作。避光條件下快速用PBS漂洗3次，置于熒光顯微鏡下，觀察，拍照，Map-2和Cy3免疫熒光，陽(yáng)性細(xì)胞的胞體和樹(shù)突分別會(huì)呈現(xiàn)綠色熒光和橙紅色熒光。

結(jié) 果

1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

圖1顯示，培養(yǎng)24h后，大部分海馬神經(jīng)元一已貼壁，胞體透亮、飽滿，較強(qiáng)立體感，細(xì)胞周?chē)泄鈺?，折光性?qiáng)。其少數(shù)細(xì)胞已長(zhǎng)出突起，長(zhǎng)短不一，但未見(jiàn)相鄰?fù)黄鹬g的連接。培養(yǎng)3～5d時(shí)，神經(jīng)元呈現(xiàn)典型形狀，胞體明顯增大，多為圓形，表面光滑，折光性強(qiáng)，突起明顯增長(zhǎng)，可見(jiàn)較多突起相互連接成稀疏網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)7～9d時(shí)，神經(jīng)元胞體開(kāi)始聚集，突起增粗增長(zhǎng)，突起形成的網(wǎng)絡(luò)更密集。

2 海馬神經(jīng)元的鑒定

取第8天的海馬神經(jīng)元進(jìn)行cy3和Map-2免疫熒光鑒定，所培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài)典型片，細(xì)胞核染色清晰，細(xì)胞與細(xì)胞間成網(wǎng)狀連接，細(xì)胞發(fā)出明顯的紅色熒光和綠色熒光，，純度達(dá)98%以上。

討 論

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特殊結(jié)構(gòu)，涉及學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)等多種復(fù)雜的生理功能，在臨床研究中十分廣泛，且對(duì)缺氧極為敏感，因此建立海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，是促進(jìn)神經(jīng)元相關(guān)疾病研究的必要條件[3，4]。為獲得純度更高、更接近人體狀態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞，在檢索大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)以往的培養(yǎng)方法做了以下改進(jìn)。

1 動(dòng)物選擇

理論上海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)應(yīng)選擇胎鼠，但胎鼠的鼠齡難以掌握加之海馬非常小加大取材難度，所以本實(shí)驗(yàn)選用出生24h的乳鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，降低操作過(guò)程的復(fù)雜度，且不傷害孕鼠，節(jié)約資源。

2 控制溫度和時(shí)間

將乳鼠全腦組織置于預(yù)冷的PBS溶液中，再分離海馬，低溫環(huán)境可以降低細(xì)胞代謝率，維持細(xì)胞充分的活力。每只乳鼠的取材時(shí)間控制在3～5min，總的時(shí)間控制在60min內(nèi)，以時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成神經(jīng)元失去活力甚至死亡。

3 消化過(guò)程不可過(guò)長(zhǎng)

整個(gè)消化過(guò)程在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每隔5min搖勻1次以充分消化。

圖2 海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀態(tài)（×200）

圖3 免疫熒光檢測(cè)海馬神經(jīng)元（×400，第8天）

4 吹打力度和次數(shù)

終止消化后，通過(guò)吹打獲得單細(xì)胞原液，力度要溫和，本實(shí)驗(yàn)使用1mL槍頭代替膠頭滴管進(jìn)行吹打，最終獲得單細(xì)胞懸液。

5 培養(yǎng)基的區(qū)分

本實(shí)驗(yàn)選用含10%血清的F12/DMEM培養(yǎng)基作為終止消化的接種培養(yǎng)基；第二天半量換液及置換換液選用Neurobasal+B27培養(yǎng)基（含0.2mol/L-1的谷氨酰胺）。Neurobasal培養(yǎng)基成分清楚，含有多種抗氧化劑，能夠保持神經(jīng)元的活性，有利于實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定[5]；B27具有保護(hù)神經(jīng)元的作用；谷氨酰胺為神經(jīng)元代謝所必需物質(zhì)[6]，但容易降解，故2周應(yīng)重新添加至完全培養(yǎng)基中。

6 不添加雙抗和阿糖胞苷

雙抗對(duì)細(xì)胞損傷較大，阿糖胞苷具有神經(jīng)毒性，添加阿糖胞苷可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)也會(huì)損傷神經(jīng)元[7，8]，通過(guò)精細(xì)取材海馬組織，在未加雙抗和阿糖胞苷的情況下，仍可獲得純度較高的海馬神經(jīng)元。

綜上所述，本方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元較對(duì)照組更容易貼壁，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，細(xì)胞之間能夠建立神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)，形成有效的突觸聯(lián)系; 為神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)研究確定了原代神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)方法。