張曉麗 張曉紅 葉 雷 朱 偉 莊乾英 沈方臻

1.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，山東臨沂 276000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤三科，山東青島 266000

肺癌是最常見的腫瘤類型之一，嚴重威脅人類的生存和健康，屬致死率較高的惡性腫瘤之一。小細胞肺癌（small celllung cancer，SCLC）作為肺癌的一種特殊類型，屬于惡性程度極高的神經(jīng)內(nèi)分泌癌，占肺癌發(fā)生率的20%～25%[1-3]，并且近年來發(fā)病率有升高的趨勢，發(fā)生的主要原因是吸煙，也與其他環(huán)境因素、職業(yè)致癌物有關(guān)，其5年生存率極低；中老年發(fā)病率高，男性較女性多，主要的生物學(xué)行為有轉(zhuǎn)移早、增長快、對初始化療敏感、易耐藥等。SCLC惡性程度高，復(fù)發(fā)率及死亡率遠高于非小細胞肺癌（non-smalll cell lung cancer，NSCLC），目前的主要治療手段局限于手術(shù)、放化療，并且可手術(shù)的患者極少，因大部分患者發(fā)病時已失去手術(shù)機會，因此對SCLC基因?qū)W方面的深入研究，有望使分子靶向治療成為一種有效的治療新方案。

SASH1（SAM-and SH3-domaincontaining1）基因是2003年由Zeller等[3]首次發(fā)現(xiàn)，并提出其可能作為一種抑癌基因，屬于進化上保守的SLY基因家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)SASH1基因表達的蛋白產(chǎn)物在體內(nèi)多種正常組織內(nèi)廣泛存在，而在多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，如乳腺癌[3]、甲狀腺癌[4]，并與腫瘤的增殖、侵襲和遷移相關(guān)[5-8]。本研究就SASH1基因在SCLC的表達及與相關(guān)病理特征的關(guān)系展開探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年2月至2018年2月臨沂市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除后經(jīng)組織病理學(xué)診斷為SCLC石蠟標本，癌組織及癌旁組織各30例，其中男24例，女6例，平均年齡（59.20±2.12）歲。納入標椎：①病理診斷為小細胞肺癌；②未行抗腫瘤治療。排除標準：①腫瘤復(fù)發(fā)患者；②合并其他類型腫瘤或其他嚴重疾病。所有患者術(shù)前均無相關(guān)放化療史，臨床病歷資料完善。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 觀察指標

①SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達情況；②SASH1基因表達與SCLC臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）的關(guān)系。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

所有手術(shù)標本應(yīng)用福爾馬林固定，固定完成后標本行4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟及水化后，應(yīng)用檸檬酸鹽溶液抗原修復(fù)處理，之后自然冷卻至室溫，再經(jīng)3% H2O2阻斷其內(nèi)源性過氧化物酶活性。用10%山羊血清封閉，以抗SASH1多克隆抗體（abcam，ab111901）孵育，4℃過夜。次日復(fù)溫至室溫后使用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（中杉金橋，ZB2301）孵育，DAB顯色。用蘇木素染核1 min，并經(jīng)過脫水、透明、封片、晾干過程。使用PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 染色結(jié)果判讀

應(yīng)用雙盲方法進行評估，由兩位病理科經(jīng)驗豐富的醫(yī)生在100倍鏡下分別進行閱片。染色強度記為：0分：無染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。按陽性細胞數(shù)百分比計分：0分：陰性；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。兩項積分乘積＜3分判為陰性，≥3分判為陽性。之后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，分析SASH1蛋白在SCLC中的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達

SASH1蛋白主要在SCLC癌組織及癌旁組織的細胞質(zhì)中表達，部分細胞核中亦有表達（圖1）。30例癌組織中，有13例表達SASH1蛋白，表達陽性率為43.33%，30例癌旁組織中，有26例表達SASH1蛋白，表達陽性率為86.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.381，P＜0.001），見表1。

表1 SASH1蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達

圖1 SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達

2.2 SASH1基因表達與SCLC臨床病理特征的關(guān)系

SASH1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率（70.00%）高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（30.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SASH1在不同性別組、年齡組、腫瘤長徑組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 SASH1基因表達與SCLC臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

SCLC被認為是一種全身性疾病，以化療為主聯(lián)合放療和（或）手術(shù)等綜合性治療。過去幾十年治療過程中，SCLC的一線化療方案仍以依托泊苷聯(lián)合鉑類為主的方案，盡管其暫時對放化療敏感，但很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來NSCLC靶向治療突飛猛進，而SCLC近40年來的治療缺乏突破性進展。因此，探索SCLC的基因?qū)W研究，能為SCLC的治療帶來一線希望。

SASH1基因是2003年Zeller等[3]在研究乳腺癌過程中發(fā)現(xiàn)的一種新基因，并提出該基因可能是乳腺癌一種新的抑癌基因。Zeller通過分析該基因，將其命名為SAM-andSH3-domaincontaining1。SASH1被認為影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這種推測在U251膠質(zhì)瘤細胞[5]、A549人肺腺癌細胞[6]、A-375黑色素瘤細胞[7]、MG-63骨肉瘤細胞[6]中得到了證實。SASH1可通過多種途徑應(yīng)用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有的研究表明腫瘤抑癌基因SASH1的缺失或下調(diào)表達足以引起上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。E-鈣黏蛋白的表達減少或缺失在腫瘤進展為侵襲性癌的過程中扮演著重要的角色，并且是EMT一個公認的標志物[9]。Dongre等[10]發(fā)現(xiàn)EMT的激活會引起細胞極性的喪失、細胞間連接的破壞、基底膜降解以及細胞外基質(zhì)的重組。Franke等[11]在研究結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，SASH1的缺失可誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且此過程通過CRKL介導(dǎo)的SRC信號途徑。Zong等[12]發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-SASH1可有效增加TSGH細胞中SASH1蛋白的表達，TGF-B1誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白下調(diào)及N-鈣黏蛋白上調(diào)的情況在SASH1轉(zhuǎn)染的TSGH細胞中逆轉(zhuǎn)。EMT的分化過程將上皮細胞轉(zhuǎn)化為侵襲性強的間充質(zhì)樣細胞，被認為是形成轉(zhuǎn)移瘤的前提[13-15]。細胞因子誘導(dǎo)的EMT導(dǎo)致SASH1在癌細胞群中表達顯著降低。而SASH1過表達減少了細胞遷移，增加了細胞基質(zhì)黏附[16]。因此，多項證據(jù)表明，兩者之間存在相互關(guān)系，并將SASH1作為EMT的關(guān)鍵負調(diào)控因子。缺氧誘導(dǎo)的EMT在胰腺癌中被證明可獨立下調(diào)SASH1的表達[17]。因此在EMT過程中下調(diào)SASH1的表達可促進上皮細胞向間充質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化。SASH1蛋白可調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，SASH1蛋白通過FAK及AKT/PI3K[4，18]調(diào)節(jié)信號，并且過度表達可促進凋亡[6，8]。有研究結(jié)果顯示SASH1蛋白與ERK信號通路有很強的關(guān)聯(lián)性，ERK信號通路中的重要成員MAP2K2和MAP4K4，與SASH1蛋白存在蛋白-蛋白相互作用，并且SASH1蛋白的表達抑制可以增強ERK1/2的磷酸化水平，意味著SASH1蛋白可能通過與MAP2K2和MAP4K4分子的相互作用參與了ERK信號通路，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等細胞過程[19]。鄺中淑等[20]證實了乳腺癌中p53與SASH1的表達存在一定的相關(guān)性，突變型及野生型SASH1基因上調(diào)內(nèi)源性及外源性p53表達，該研究中發(fā)現(xiàn)突變型p53可抑制SASH1基因的表達，導(dǎo)致SASH1蛋白表達下調(diào)，從而在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。根據(jù)以往的研究，SASH1基因的表達下調(diào)可能與SASH1啟動子的高甲基化有關(guān)[3]。在對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，SASH1蛋白過表達的細胞株中，MMP-2/9減低，而Caspases-3升高，提示SASH1蛋白可能干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、凋亡等過程[5]。

本研究結(jié)果顯示，SASH1蛋白在SCLC癌組織中的表達陽性率明顯低于癌旁組織中的，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCLC患者的SASH1陽性表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCLC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而SASH1在不同性別組、年齡組、腫瘤大小組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。通過以上結(jié)果，SASH1基因在SCLC癌組織及癌旁組織的表達的差異性，與此基因在其他癌種中的研究結(jié)果相符，提示SASH1基因可能是SCLC的抑癌基因。因SCLC能早期發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)治療的病例較少，導(dǎo)致本研究收集的樣本量相對較少。筆者將繼續(xù)致力于SASH1基因與SCLC的相關(guān)性研究，以期尋找SCLC新的治療方法。