李永波，崔德周，黃琛，隋新霞，樊慶琦，楚秀生，2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

小麥?zhǔn)侨蜃钪匾募Z食作物之一。小麥穎果由外向內(nèi)依次由外果皮、種皮、糊粉層和胚乳組成［1］。在小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中，外層果皮和內(nèi)層胚乳細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性細(xì)胞死亡（PCD），表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核DNA降解以及核酸酶活性增加等［2］。籽粒的這種PCD是為蛋白質(zhì)和淀粉合成提供場(chǎng)所以及為其它細(xì)胞提供能量供應(yīng)［3，4］，其進(jìn)程直接影響小麥灌漿、籽粒大小和品質(zhì)。因此，研究小麥籽粒PCD及相關(guān)細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種具有重要的理論指導(dǎo)意義。

植物PCD是內(nèi)部基因有序地調(diào)控組織細(xì)胞降解的過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育及適應(yīng)外界環(huán)境因子的脅迫具有重要意義［5］。種子成熟過(guò)程中，PCD的發(fā)生受干旱［6］、澇害［7］、激素等多種環(huán)境因素的影響。干旱可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而導(dǎo)致PCD［6］；澇害會(huì)引起胚乳細(xì)胞染色質(zhì)凝聚、核退化、線粒體破裂等PCD特點(diǎn)［8］；花后高溫會(huì)加速小麥胚乳細(xì)胞的降解［9］；乙烯會(huì)加速小麥種子PCD，而ABA則延遲PCD［10］。小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中會(huì)應(yīng)對(duì)干旱、干熱風(fēng)等各種復(fù)雜多變的環(huán)境，環(huán)境因子決定了籽粒PCD進(jìn)程，因此研究小麥籽粒PCD的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程對(duì)適應(yīng)外界環(huán)境脅迫、保證后期籽粒正常灌漿意義重大。

本研究以高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗倒、廣適小麥新品種濟(jì)麥70為材料，探究其籽粒發(fā)育過(guò)程中內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)變化與PCD進(jìn)程的對(duì)應(yīng)關(guān)系及內(nèi)源激素ABA的動(dòng)態(tài)變化，以期為進(jìn)一步探究PCD調(diào)控小麥籽粒發(fā)育的分子機(jī)理奠定重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥新品種濟(jì)麥70由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育，于2020年通過(guò)山東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，編號(hào)為魯審麥20200005，其主要特點(diǎn)是產(chǎn)量潛力高、高抗倒伏、抗病性好、廣適等。

1.2 番紅固綠染色

取開(kāi)花后5、10、15、20、25 d具有代表性的小麥籽粒3粒進(jìn)行石蠟切片。依次將切片放入二甲苯中20 min，無(wú)水乙醇中5 min，75%乙醇中5 min，然后用自來(lái)水清洗。清洗好的片子放入番紅染液中染色1～2 h，用自來(lái)水洗去多余的染料。接下來(lái)將切片依次放入50%、70%、80%梯度乙醇中各3～8 s，然后放入固綠染液中染色30～60 s，用無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水。最后，將切片置于二甲苯中透明5 min，然后用中性樹(shù)膠封片，用熒光顯微鏡（Axiocam，卡爾蔡司，Germany）進(jìn)行拍照（放大100倍）。

1.3 DNA梯度檢測(cè)

取開(kāi)花后5、10、15、20、25 d的小麥籽粒，用細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒（C30007，碧云天，上海）對(duì)籽粒中的DNA進(jìn)行分離，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。取1μg DNA上樣，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 內(nèi)源性激素測(cè)定

利用植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，對(duì)小麥籽粒中的內(nèi)源激素進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟詳見(jiàn)文獻(xiàn)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)動(dòng)態(tài)變化與其PCD進(jìn)程動(dòng)態(tài)關(guān)系

對(duì)開(kāi)花后5、10、15、20、25 d的小麥品種濟(jì)麥70籽粒進(jìn)行番紅-甲基綠染色和DNA梯度檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，開(kāi)花后5 d，所有籽粒細(xì)胞呈橢圓形，扇狀排布，細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)分化現(xiàn)象；開(kāi)花后10 d，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象，最內(nèi)部致密的胚乳細(xì)胞、包裹著胚乳的1～2層糊粉層細(xì)胞、單層種皮細(xì)胞以及最外面的多層果皮細(xì)胞等出現(xiàn)；開(kāi)花后15 d，果皮細(xì)胞層數(shù)減少，胚乳細(xì)胞開(kāi)始皺縮；開(kāi)花后20、25 d，果皮只有單層細(xì)胞，而胚乳細(xì)胞出現(xiàn)破裂（圖1）。DNA梯度檢測(cè)結(jié)果顯示，只有到達(dá)開(kāi)花后15 d時(shí)，DNA片段的斷裂現(xiàn)象才開(kāi)始出現(xiàn)，表明在開(kāi)花后15～25 d范圍內(nèi)，小麥籽粒細(xì)胞正在發(fā)生PCD（圖2）。綜上所述，小麥籽粒果皮細(xì)胞層數(shù)的減少及胚乳細(xì)胞的皺縮、破裂現(xiàn)象是一種PCD過(guò)程。

圖1 小麥籽粒內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（100×）

圖2 DNA梯度檢測(cè)

2.2 內(nèi)源植物激素的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)開(kāi)花后不同時(shí)間點(diǎn)濟(jì)麥70籽粒內(nèi)源植物激素含量的分析結(jié)果（圖3）顯示，脫落酸（ABA）含量在開(kāi)花后5～10 d呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10～25 d一直保持上升趨勢(shì)；生長(zhǎng)素（IAA）含量在開(kāi)花后5～10 d呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，10～20 d下降，之后又上升；赤霉素（GA）含量在5～15 d呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，15～20 d快速上升，20～25 d保持平穩(wěn)；而玉米素核苷（ZR）卻在5～25 d持續(xù)下降?？梢钥闯?，只有脫落酸含量的變化趨勢(shì)與籽粒PCD的發(fā)生時(shí)間比較吻合，因此推測(cè)，小麥籽粒發(fā)育后期脫落酸含量的增加，可能促進(jìn)了小麥籽粒PCD的發(fā)生；但是籽粒發(fā)育期間所出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)變化，可能是由多種內(nèi)源植物激素協(xié)同作用的結(jié)果。

圖3 花后5～25 d小麥籽粒內(nèi)源植物激素含量變化

3 討論與結(jié)論

小麥作為重要的糧食作物，其籽粒灌漿與產(chǎn)量和品質(zhì)息息相關(guān)。小麥籽粒早期發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目增加、細(xì)胞分化、PCD以及內(nèi)源植物激素變化等現(xiàn)象，進(jìn)而為后期灌漿做準(zhǔn)備［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA在小麥籽粒早期發(fā)育過(guò)程中持續(xù)增加，而前人研究表明ABA是影響籽粒胚乳PCD的關(guān)鍵因子，可通過(guò)影響乙烯合成途徑影響胚乳PCD［15］，因此，推測(cè)籽粒早期的PCD現(xiàn)象可能受ABA調(diào)控。

小麥穎果在發(fā)育早期會(huì)出現(xiàn)果皮厚度變薄、細(xì)胞層數(shù)減少的現(xiàn)象。根據(jù)形態(tài)學(xué)及淀粉積累程度特點(diǎn)，可將籽粒果皮的發(fā)育過(guò)程分為生長(zhǎng)期、形成期、消失期和成熟期［9，16］。本研究發(fā)現(xiàn)，花后15 d出現(xiàn)果皮層數(shù)減少、胚乳細(xì)胞破裂并伴隨PCD現(xiàn)象，推測(cè)此時(shí)果皮已進(jìn)入消失期，通過(guò)PCD為籽粒灌漿擴(kuò)容提供容納淀粉的充足內(nèi)部空間。小麥籽粒早期的發(fā)育過(guò)程，會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、PCD現(xiàn)象，并伴隨著植物內(nèi)源激素的不斷變化，這種種變化是為保證其籽粒灌漿能夠順利進(jìn)行而準(zhǔn)備的。小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中的PCD發(fā)生部位是在果皮和胚乳細(xì)胞中，如小麥品種華麥8果皮細(xì)胞在花后0～15 d完成PCD過(guò)程［3］，新冬18和新冬22胚乳細(xì)胞在花后15～25 d完成PCD［6］，而小麥新品種濟(jì)麥70在花后15～20 d可檢測(cè)到PCD現(xiàn)象，這是典型的胚乳PCD發(fā)生時(shí)間，但卻在花后5～20 d內(nèi)完成果皮的降解，這與前人研究相比有所延緩，這種PCD的差異可能與小麥品種以及氣候條件差異有關(guān)。

盡管本研究對(duì)小麥新品種濟(jì)麥70籽粒早期發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)變化、內(nèi)源植物激素含量以及PCD現(xiàn)象做了初步解析，但對(duì)其上游調(diào)控PCD的基因是什么、ABA參與調(diào)控PCD的分子機(jī)理等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。