陳志偉，宮文萍，韓冉，李豪圣，劉建軍，賈舉慶，劉成

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100）

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，為全世界人類提供了大約20%的能量［1］。我國的小麥種植面積約是世界小麥種植面積的十分之一，播種面積僅次于玉米和水稻，是我國第三大糧食作物。近年來，我國小麥單產(chǎn)穩(wěn)步提升、總產(chǎn)持續(xù)增長(zhǎng)，小麥生產(chǎn)取得了舉世矚目的成就［2］。然而，長(zhǎng)期以來育種家們對(duì)少數(shù)骨干親本的大量利用及相似品種間的相互雜交，容易造成品種抗源日趨單一化和遺傳變異范圍縮小等問題［3］，一旦新致病生理小種爆發(fā)，將很難應(yīng)對(duì)。因此，通過遺傳改良并培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種是解決上述問題的關(guān)鍵。小麥野生近緣種中含有抗病、抗逆和多分蘗等優(yōu)異性狀，是小麥的優(yōu)異基因源［4］，育種家可以通過小麥遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種。

向小麥引進(jìn)近緣物種的優(yōu)異基因通常過程是先將二者雜交，獲得小麥-近緣植物雙二倍體或部分雙二倍體［3，5］；再將雙二倍體或部分雙二倍體與小麥進(jìn)行雜交回交，獲得小麥-近緣植物附加系或代換系［3，5，6］；然后，再將附加系或代換系與小麥或ph1b基因缺失突變體進(jìn)行雜交回交，獲得易位系或端體系［3，7］。其中，小麥-近緣植物雙二倍體、部分雙二倍體、附加系和代換系是近緣植物向小麥轉(zhuǎn)移優(yōu)異基因的橋梁材料，附加系、代換系、易位系和端體系是定位和利用近緣植物優(yōu)異基因的重要材料［3］。

智利大麥?zhǔn)切←湼牧嫉膬?yōu)異近緣物種，主要分布在智利和阿根廷，基因組為HchHch，高抗葉銹病、白粉病和全蝕病等病害［8，9］，同時(shí)具有耐干旱［10］和耐鹽［10，11］等特點(diǎn)。目前，已有小麥-智利大麥雙二倍體和附加系創(chuàng)制的報(bào)道［3，8，12，13］，但有關(guān)端體系的報(bào)道非常少見。鑒于此，本研究利用熒光原位雜交和分子標(biāo)記等方法對(duì)小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交后代進(jìn)行篩選，鑒定出小麥-智利大麥1HchS單端體系和1HchL雙端體系，為將源自智利大麥1Hch染色體的耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲基因［8］定位到染色體臂上提供了重要材料，并獲得了可以追蹤小麥背景中智利大麥1Hch染色體的特異分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥中國春（Chinese Spring，CS）由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。濟(jì)麥22（JM22）和濟(jì)麥23（JM23）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團(tuán)隊(duì)培育。中國春-智利大麥雙二倍體（CS-Hchamp）和中國春-智利大麥1Hch＋1HchS附加系（Heter CS-Hchadd）由英國約翰英納斯中心（John Innes Centre，JIC）的Reader S M教授提供。中國春-智利大麥4Hch附加系（TA7588）、5Hch附加系（TA7589）、6Hch附加系（TA7590）以及7Hch附加系（TA7591）由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心（Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC）的Gill B S提供。ZLDM1—ZLDM50為小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取約100 mg的葉片放入2 mL離心管（提前加入直徑2 mm的鋼珠）中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192組織研磨機(jī)在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，提取方法參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.2 IT引物與PLUG引物的PCR擴(kuò)增及電泳 IT引物序列及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)［15］，PLUG引物序列及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)［16］。染色體第一同源群的135對(duì)IT引物和26對(duì)PLUG引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。IT-PCR和PLUG-PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后凝膠在紫外凝膠成像儀GDS-Gel Dol 2000下掃描照相。

1.2.3 染色體制片與熒光原位雜交 試驗(yàn)材料的根尖處理和染色體制片方法，以O(shè)ligopSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針進(jìn)行的原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）所用探針合成、探針濃度、具體操作步驟，以及原位雜交染色體制片自然干燥后的具體操作步驟等參見文獻(xiàn)［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-智利大麥染色體端體系的篩選與鑒定

以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針的FISH可以鑒定出小麥背景中的智利大麥1Hch染色體，且其染色體長(zhǎng)臂和短臂信號(hào)不同［8］。本研究以上述兩探針的FISH對(duì)小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50進(jìn)行篩選與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個(gè)單株中，20個(gè)單株含整條1Hch染色體，12個(gè)單株含1HchS和1HchL端體，13個(gè)單株無外緣染色體，ZLDM7和ZLDM43含1條1HchL染色體，ZLDM29含1對(duì)1HchL染 色 體，ZLDM14和ZLDM37含1條1HchS染色體。對(duì)ZLDM29和ZLDM37進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，二者的染色體條數(shù)分別為42＋2t（t＝telosomics）和42＋t，外緣染色體臂雜交信號(hào)與文獻(xiàn)相同，因此，ZLDM29和ZLDM37分別是小麥-智利大麥1HchL雙端體系（圖1A）和1HchS單端體系（圖1B）。

圖1 寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)供試材料的鑒定結(jié)果

2.2 染色體第一同源群IT引物與PLUG引物篩選

以中國春和中國春-智利大麥雙二倍體為材料，篩選合成的染色體第一同源群IT引物和PLUG引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超過95%的引物均能在供試材料中擴(kuò)增出明顯的2～3條DNA條帶。相比中國春，PLUG引物中的TNAC1530、TNAC1535和TNAC1536可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴(kuò)增出額外的多態(tài)性條帶（圖2A）；IT引物中的CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴(kuò)增出額外的多態(tài)性條帶（圖2B）。上述條帶可能可作為分子標(biāo)記用于檢測(cè)小麥背景中智利大麥染色質(zhì)。

圖2 IT引物和PLUG引物在中國春和中國春-智利大麥雙二倍體中的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 智利大麥基因組多態(tài)性DNA片段的染色體定位

為了驗(yàn)證上述IT引物和PLUG引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶在檢測(cè)小麥背景中智利大麥染色質(zhì)的可行性及確定它們?cè)谥抢篼溔旧w上的定位，用引 物TNAC1530、TNAC1535、TNAC1536、CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187對(duì)中國春-智利大麥1Hch＋1HchS附加系、1HchL單端體系、1HchL雙端體系、1HchS＋1HchL端體系、1HchS單端體系、4Hch附加系、5Hch附加系、6Hch附加系、7Hch附加系、1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50以及濟(jì)麥22和濟(jì)麥23進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅引物CINAU1186和TNAC1536可以在含1HchL的材料中擴(kuò)增出長(zhǎng)度分別為350 bp和700 bp的特異多態(tài)性條帶（圖3），而在其他材料中擴(kuò)增不出這些多態(tài)性條帶（除TNAC1536能在6Hch附加系中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶），因此，這些多態(tài)性條帶可以作為分子標(biāo)記檢測(cè)小麥背景中的1HchL染色質(zhì)。引物TNAC1530、TNAC1535、CINAU1185和CINAU1187未能像預(yù)期一樣在除中國春-智利大麥雙二倍體外的供試材料中擴(kuò)增出目標(biāo)多態(tài)性帶，表明這些多態(tài)性條帶可能在中國春-智利大麥雙二倍體與小麥雜交回交過程中丟失或?qū)?yīng)基因序列發(fā)生了變異。引物CINAU1186和TNAC1536的序列信息如表1所示。

圖3 引物CINAU1186和TNAC1536在部分供試材料中的擴(kuò)增結(jié)果

表1 獲得智利大麥染色體特異分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物信息

3 討論與結(jié)論

在小麥-智利大麥染色體系創(chuàng)制方面，Miller等［17］最早在1981年開展了將智利大麥染色質(zhì)轉(zhuǎn)移給小麥的研究，獲得了小麥-智利大麥雙二倍體以及4Hch—7Hch附加系等種質(zhì)。Antonio Fernández［18］、Padilla［19］等也先后在1985年 和1987年開展了四倍體小麥和智利大麥雜交工作并獲得了染色體雙二倍體。1990年，我國學(xué)者蔣繼明和劉大均也通過離體幼胚培養(yǎng)和回交等方法獲得了小麥-智利大麥BC1F1材料［20］。Del Carmen等［21］在2012年將智利大麥4Hch染色體導(dǎo)入硬粒小麥，獲得了硬粒小麥-智利大麥4Hch代換系和附加系。Mattera等［13］在2015年創(chuàng)制出了小麥-智利大麥7Hch染色體漸滲系。Mattera和Cabrera于2017年將中國春-圓柱山羊草2C染色體附加系與小麥-智利大麥7Hch（7D）附加系進(jìn)行雜交，獲得了3個(gè)純合的小麥-智利大麥羅伯遜易位系［22］。2019年，Palomino和Cabrera又創(chuàng)制出了小麥-智利大麥2Hch染色體漸滲系［23］。上述研究中未發(fā)現(xiàn)涉及小麥-智利大麥1Hch端體系創(chuàng)制的報(bào)道，因?yàn)?Hch上含有耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲等重要基因，因此，創(chuàng)制涉及智利大麥1Hch的染色體端體系對(duì)定位和利用相關(guān)基因具有重要價(jià)值。鑒于此，本研究從小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交后代中鑒定出了小麥-智利大麥1HchS端體系和1HchL端體系，為智利大麥優(yōu)異基因定位提供了工具材料。

在智利大麥染色體特異標(biāo)記建立方面，Miller等［17］利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等對(duì)智利大麥染色體同源群歸屬進(jìn)行了鑒定。Hueros等［24］從智利大麥中發(fā)掘出特異重復(fù)序列作為探針用于有效區(qū)分小麥和智利大麥染色體。Hernáhndez等［25］利用RAPD引物對(duì)小麥-智利大麥附加系等材料進(jìn)行擴(kuò)增，獲得智利大麥特異RAPD片段進(jìn)行克隆測(cè)序并將其轉(zhuǎn)化成了STS標(biāo)記。Castillo等［26］利用EST-SSR引物對(duì)不同的智利大麥和小麥-大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增，建立了智利大麥EST-SSR標(biāo)記。Said和Cabrera［27］設(shè)計(jì)了大麥染色體4H特異引物對(duì)智利大麥和小麥進(jìn)行擴(kuò)增，建立了智利大麥4Hch染色體特異SSR標(biāo)記、EST-SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記。Mattera等［13］利用染色體第7同源群上的EST和COS引物對(duì)智利大麥和小麥等材料進(jìn)行擴(kuò)增，建立了智利大麥染色體第4Hch染色體特異分子標(biāo)記。Mattera和Cabrera［22］以智利大麥7Hch上八氫番茄紅素合成酶（Psy1）基因序列為基礎(chǔ)開發(fā)了該基因標(biāo)記用于對(duì)小麥-智利大麥雜交后代進(jìn)行鑒定。上述研究未見智利大麥1Hch染色體特異分子標(biāo)記建立的報(bào)道。鑒于此，本研究以源自簇毛麥的IT引物和源自水稻的PLUG引物對(duì)從小麥、小麥-智利大麥染色體系、小麥-智利大麥雜交分離群體等進(jìn)行擴(kuò)增，建立了智利大麥1HchL染色體臂特異分子標(biāo)記，為小麥背景中1HchL染色體臂追蹤提供了檢測(cè)方法。然而，本研究未在小麥和小麥-智利大麥1HchS端體系間發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，需今后重點(diǎn)開發(fā)該染色體臂特異分子標(biāo)記。