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        小偃麥滲入系苗期耐鹽鑒定與分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

        2021-06-09 03:45:18喬麟軼張瀟文李世姣陳芳李欣郭慧娟張樹偉常利芳張曉軍暢志堅(jiān)
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期

        喬麟軼,張瀟文,李世姣,陳芳,李欣,郭慧娟,張樹偉,常利芳,張曉軍,暢志堅(jiān)

        (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030031;2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院,山西 太原 030006)

        土壤鹽漬化嚴(yán)重影響作物的正常生長和產(chǎn)量。目前我國東北、西北、黃河三角洲及沿海等地區(qū)的鹽漬化土壤面積高達(dá)3.6×107hm2[1,2],已成為限制作物增產(chǎn)的主要因素之一。小麥?zhǔn)俏覈闹骷Z作物,隨著人口增長對(duì)糧食需求的不斷加大,增強(qiáng)小麥對(duì)鹽漬土壤的耐受性進(jìn)而提高其產(chǎn)量,對(duì)于保障國家的糧食安全意義重大。

        廣泛發(fā)掘耐鹽種質(zhì)是選育小麥耐鹽品種的前提。偃麥草屬 (Thinopyrum)植物隸屬禾本科小麥族,可在鹽堿地或?yàn)┩可L,是小麥抗逆性改良的優(yōu)異基因庫[3]。長期以來,育種家通過遠(yuǎn)緣雜交或體細(xì)胞融合技術(shù)將偃麥草遺傳片段導(dǎo)入小麥,創(chuàng)制了小偃麥種質(zhì),并據(jù)此選育出耐鹽品種用于生產(chǎn)[3-5]。例如源自中間偃麥草 (Th.intermedium)的山農(nóng)120211[6]和源自長穗偃麥草 (Th.ponticum)的小偃6號(hào)[7]、山融3號(hào)[8]都表現(xiàn)出很好的耐鹽性。其中,山融3號(hào)攜帶的耐鹽基因被定位在5A染色體上[9,10]。

        本實(shí)驗(yàn)室自1986年起利用染色體異源重組將中間偃麥草片段轉(zhuǎn)移至普通小麥,創(chuàng)制了TAI7045、TAI7047和TAI8335等多個(gè)八倍體小偃麥新類型[11-13],并將其與普通小麥品種雜交、回交,獲得一批兼抗小麥白粉病和條銹病的小偃麥新種質(zhì)[14,15]。本研究從小偃麥TAI7047的后代滲入系中選出136份染色體數(shù)目為42的材料進(jìn)行苗期耐鹽性鑒定,并利用分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為小麥耐鹽育種提供新種質(zhì)及耐鹽新抗源。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        136份小偃麥滲入系 (晉麥33/TAI7047//*2京411的F9~F10家系)及其親本用于苗期耐鹽鑒定,小麥品種山融3號(hào)和中國春分別作為耐鹽和鹽敏感對(duì)照材料。其中,山融3號(hào)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所劉成研究員提供,其余材料均由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.2 鹽脅迫處理

        每份材料取25粒種子,先用1%的雙氧水消毒,再用蒸餾水沖洗干凈,然后放置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)。待胚根伸長至2~3 cm時(shí),選擇16粒生長勢(shì)一致的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液中生長,參數(shù)設(shè)置為16 h光照/8 h黑暗、22℃/16℃;待幼苗生長至兩葉一心期時(shí)更換含NaCl的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫,再生長7 d進(jìn)行表型鑒定。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

        預(yù)試驗(yàn)設(shè)置0、50、100、150、200、250、300、350 mmol/L NaCl共8個(gè)濃度對(duì)耐鹽對(duì)照山融3號(hào)和鹽敏感對(duì)照中國春進(jìn)行苗期耐鹽鑒定,選擇兩者耐鹽表型差異最大時(shí)的處理濃度來鑒定滲入系材料。

        1.3 表型鑒定與數(shù)據(jù)分析

        參考單雷等[9]的方法,根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《小麥耐鹽性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(NYΠPZT0012.2002)將小麥耐鹽級(jí)別劃分為0~4級(jí),對(duì)每個(gè)材料的16株幼苗分別進(jìn)行小麥葉片的鹽害程度鑒定,并計(jì)算鹽害指數(shù)。計(jì)算方法為:鹽害指數(shù)(%)=∑(0×0級(jí)苗數(shù)+1×1級(jí)苗數(shù)+2×2級(jí)苗數(shù)+3×3級(jí)苗數(shù) +4×4級(jí)苗數(shù))×100/(5×16)。

        根據(jù)鹽害指數(shù)評(píng)價(jià)材料耐鹽性,評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:高耐(0~20.0%),耐鹽 (20.1%~40.0%),中耐(40.1%~60.0%),敏感 (60.1%~80.0%)和高感 (80.1%~100.0%)。

        采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)、作圖以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

        1.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

        采用改良CTAB法[16]提取供試材料及對(duì)照品種的基因組DNA。利用山融3號(hào)耐鹽基因的連鎖分子標(biāo)記Xbarc144(F:5′-GCGTTTTAGGTGGACGACATAGATAGA-3′;R:5′-GCGCCACGGGCATTTCTCATAC-3′)[10]對(duì)小偃麥滲入系進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為10μL:ddH2O 3.5μL,PCR Mixture 5.0μL(B532061,生工生物,中國上海),引物0.5μL,DNA模板 (100 ng/μL)1.0μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30 s,58℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,12℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)電泳檢測(cè),硝酸銀染色后照相保存結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 苗期耐鹽鑒定濃度篩選

        以耐鹽對(duì)照山融3號(hào)和鹽敏感對(duì)照中國春為測(cè)試材料,設(shè)置0~350 mmol/L NaCl共8個(gè)濃度進(jìn)行苗期耐鹽鑒定。結(jié)果(圖1)顯示,隨著NaCl濃度的增加,測(cè)試材料的鹽害指數(shù)逐漸增加。在250 mmol/L NaCl濃度下,山融3號(hào)和中國春的鹽害指數(shù)分別為35.4%和73.6%,差異達(dá)到最大值,因此將250 mmol/L作為對(duì)滲入系材料進(jìn)行耐鹽篩選的鑒定濃度。

        圖1 小麥苗期耐鹽鑒定濃度的篩選

        2.2 滲入系材料苗期耐鹽鑒定

        對(duì)136份小偃麥滲入系及其親本進(jìn)行苗期耐鹽評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,外源親本TAI7047的鹽害指數(shù)為29.26%,具有耐鹽性;而小麥親本晉麥33和京411則表現(xiàn)為鹽敏感,鹽害指數(shù)分別為63.17%和70.83%。小偃麥滲入系中,耐鹽、中耐、敏感、高感材料的數(shù)量分別為9(6.6%)、62(45.6%)、62(45.6%)和3(2.2%)份,其中,有6份滲入系(CH01、CH1631、CH1696、CH1715、CH3286和CH16425)的鹽害指數(shù)低于對(duì)照品種山融3號(hào),表現(xiàn)出很好的耐鹽性(圖2,表1)。

        2.3 苗期耐鹽滲入系的分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

        利用山融3號(hào)的耐鹽基因連鎖標(biāo)記Xbarc144對(duì)136份小偃麥滲入系及其親本進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示,Xbarc144在鹽敏感小麥親本晉麥33、京411和耐鹽親本TAI7047間存在多態(tài)性,并在小偃麥滲入系中表現(xiàn)出4種標(biāo)記型,其中Xbarc144-a和Xbarc144-b型分別來自于晉麥33和京411,Xbarc144-c和Xbarc144-d型則來自于TAI7047(圖3)。然而方差分析結(jié)果 (表2、表3)顯示,4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)的鹽害指數(shù)之間無明顯差異 (F=0.27<F0.05),表明Xbarc144標(biāo)記與這批滲入系的耐鹽表型不連鎖。

        圖2 136份小偃麥滲入系的苗期耐鹽等級(jí)和分布

        表1 6份耐鹽滲入系及其親本和對(duì)照材料的苗期耐鹽表型和標(biāo)記型

        表2 Xbarc144在136份小偃麥滲入系中的4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)鹽害指數(shù)

        表3 Xbarc144的4種標(biāo)記型對(duì)應(yīng)表型值的方差分析

        圖3 Xbarc144標(biāo)記在部分小偃麥滲入系及其親本中的標(biāo)記型

        3 討論

        育種家通常將高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病等性狀作為主要育種目標(biāo),對(duì)耐鹽等抗逆表型的關(guān)注相對(duì)較少。有研究表明,現(xiàn)代小麥品種的整體耐鹽性幾乎沒有提升,而遺傳多樣性持續(xù)下降,優(yōu)異耐鹽單倍型較為單一[7]。因此,從小麥近緣物種中廣泛發(fā) 掘 耐 鹽 位 點(diǎn) 尤 為 重 要。 例 如Byrt[17]和Munns[18]等從一粒小麥 (Triticum monococcum)的漸滲系中鑒定出一個(gè)主效耐鹽位點(diǎn)Nax2,并確定TmHKT1;5為候選基因,導(dǎo)入TmHKT1;5-A的四倍體小麥在鹽堿地中增產(chǎn)達(dá)25%。而偃麥草屬鹽生植物含有更為豐富的耐鹽基因,本實(shí)驗(yàn)室歷經(jīng)30余年將中間偃麥草片段導(dǎo)入小麥,創(chuàng)制了一大批小偃麥滲入系。本研究對(duì)八倍體小偃麥TAI7047的滲入系進(jìn)行苗期耐鹽鑒定,共篩選出71份耐鹽材料,其中有6份材料的耐鹽性高于對(duì)照品種山融3號(hào),可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質(zhì)及耐鹽新抗源。

        鑒定結(jié)果顯示,這批滲入系的小麥親本晉麥33和京411均為鹽敏感材料,而親本八倍體小偃麥TAI7047則表現(xiàn)為耐鹽,表明耐鹽性來源于TAI7047。TAI7047中導(dǎo)入了中間偃麥草的2條J染色體、6條Js染色體、3條St染色體和2條Js-St染色體[12,19],初步猜測(cè)其耐鹽性可能來源于中間偃麥草,對(duì)此我們將檢測(cè)TAI7047系譜親本的苗期耐鹽表型進(jìn)行驗(yàn)證。

        由于小麥耐鹽品種山融3號(hào)的耐鹽基因來源于長穗偃麥草,而中間偃麥草(JJsSt)與長穗偃麥草 (JJsJx)具有相似的基因組組成[20],因此我們用山融3號(hào)耐鹽基因的連鎖標(biāo)記Xbarc144對(duì)小偃麥滲入系進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示滲入系的耐鹽表型與Xbarc144不連鎖,可能包含新的耐鹽位點(diǎn),這將有助于拓寬小麥的遺傳背景。

        4 結(jié)論

        利用250 mmol/L NaCl對(duì)136份小偃麥滲入系進(jìn)行苗期耐鹽鑒定,從中選出71份耐鹽材料,其抗性來自于親本TAI7047。有6份滲入系的耐鹽性(鹽害指數(shù)31.25%~35.94%)略高于對(duì)照品種山融3號(hào) (鹽害指數(shù)38.45%),可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質(zhì)。本研究中滲入系耐鹽表型與山融3號(hào)的耐鹽連鎖標(biāo)記Xbarc144不連鎖,可能具有新的耐鹽位點(diǎn),拓寬了小麥的耐鹽遺傳背景。

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