郭營(yíng)，孫俊生，屈春艷，2，郭寶晉，趙巖，李斯深

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)／作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2.棗莊學(xué)院，山東 棗莊 277160）

小麥黃花葉病是由小麥黃花葉病病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的一種土傳病害，以土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）為傳毒介體。近年來(lái)，該病害在我國(guó)冬麥區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，已逐漸成為生產(chǎn)上的一種重要病害，主要發(fā)生在黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)的部分地區(qū)和西南冬麥區(qū)的四川盆地等［1-3］。由于該病毒存在于禾谷多黏菌休眠孢子體內(nèi)，而禾谷多黏菌休眠孢子堆壁厚，具有很強(qiáng)的抗逆性，因此很難用化學(xué)方法防治。鑒定篩選抗源、選育小麥黃花葉病抗性品種是控制該病害的根本途徑。國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了一些小麥抗黃花葉病種質(zhì)的篩選工作，如孫炳劍等［4］對(duì)河南62個(gè)主推小麥品種進(jìn)行了小麥黃花葉病的抗性評(píng)價(jià)，篩選出揚(yáng)輻9311、寧麥9號(hào)等10個(gè)抗病品種；魏瑋等［5］對(duì)國(guó)內(nèi)外527個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行小麥黃花葉病抗性鑒定，篩選出包括豐抗1號(hào)、石家莊72、鄭麥9023等10個(gè)抗病品種；劉麗娟等［6］對(duì)黃淮地區(qū)的145個(gè)小麥品種進(jìn)行小麥黃花葉病抗性評(píng)價(jià)，篩選出濮優(yōu)938、新麥208等70個(gè)免疫品種，豫麥47、邯6172等50個(gè)抗病品種。

小麥黃花葉病抗性是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，受基因型和環(huán)境效應(yīng)影響顯著。連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析已成為數(shù)量性狀基因定位和挖掘的重要途徑。前人利用F2、重組自交系（recombinant inbred lines，RIL）等遺傳分析群體，在2A、2D、3B、4D、5A和7B等染色體上檢測(cè)到多個(gè)小麥黃花葉病抗性的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）［7-12］。相較于連鎖分析，全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）以自然群體為材料，來(lái)源廣泛（如野生種、地方品種、現(xiàn)代品種和高代品系），基因多態(tài)性較高，無(wú)需構(gòu)建雙親群體，具有發(fā)掘效率高、分辨率高且成本較低的優(yōu)點(diǎn)，目前利用自然群體進(jìn)行小麥黃花葉病抗性的研究較少。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，具有在基因組中數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定性高、可自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已開(kāi)發(fā)出多款小麥SNP芯片，如9K、90K、55K、660K和820K芯片［13-18］，為GWAS分析提供了高基因組覆蓋度的基因型分型數(shù)據(jù)，并在小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等相關(guān)性狀基因的挖掘中得到了廣泛應(yīng)用［19-23］。

本研究對(duì)我國(guó)黃淮麥區(qū)134份小麥品種（系）進(jìn)行小麥黃花葉病抗性鑒定，以期篩選出抗病種質(zhì)，為育種家提供優(yōu)異抗源。結(jié)合90K SNP芯片基因型分型數(shù)據(jù)和病情指數(shù)，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，以期獲得顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為小麥黃花葉病抗性遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為我國(guó)黃淮麥區(qū)134個(gè)小麥品種（系）組成的自然品種群體（表1）。供試材料分別于2014—2015（E1）、2015—2016（E2）、2016—2017（E3）年度種植于山東省泰安市岱岳區(qū)小麥黃花葉病連續(xù)多年均勻發(fā)病的自然病圃。田間種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每年10月中上旬播種，每材料種植3行，行長(zhǎng)1.5 m，行距25 cm，每行點(diǎn)播40粒種子，重復(fù)2次，常規(guī)田間管理。

1.2 小麥黃花葉病抗性鑒定

分別于2015年（3月14日）、2016年（3月4日、3月21日）、2017年（3月11日、3月21日）進(jìn)行田間抗病性鑒定，每個(gè)材料調(diào)查全部植株。單株抗性鑒定分級(jí)參照劉偉華等［24］的指標(biāo)：0級(jí)，無(wú)癥狀；1級(jí)，輕度花葉，葉片不產(chǎn)生梭狀條紋癥狀，植株不矮化；2級(jí)，花葉明顯，梭條或黃花葉癥狀占葉面積的1／2左右，植株輕度矮化；3級(jí)，嚴(yán)重花葉，梭條或黃花葉癥狀占葉面積的3／4左右，植株明顯矮化。根據(jù)單株病級(jí)鑒定結(jié)果，計(jì)算病情指數(shù)（disease index，DI），計(jì)算公式為：病情指數(shù)＝Σ（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）／（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100。每個(gè)供試材料在同一時(shí)間鑒定的2個(gè)重復(fù)DI抗性結(jié)果取平均值，同一年的兩次抗性結(jié)果以DI較大值作為該品種（系）該年度抗性結(jié)果。品種抗病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：抗病（R），DI＜5%；中抗（MR），5%≤DI＜15%；中感（MS），15%≤DI＜25%；感?。⊿），DI≥25%［24］。

1.3 基因型分型

利用小麥90K SNP芯片［13］對(duì)品種群體進(jìn)行基因型分型。在得到的多態(tài)性SNP中，去除最小等位基因頻率（MAF）小于5%、缺失率大于15%的SNP位點(diǎn)，7 357個(gè)SNP有遺傳位置信息，分布在21條染色體上，用于下一步的關(guān)聯(lián)分析［25］。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 5.0軟件，采用混合線性模型（MLM），以主成分分析（PCA）和親緣關(guān)系（Kinship）作為協(xié)變量，結(jié)合7 357個(gè)SNP標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，對(duì)134份小麥品種（系）的DI值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，設(shè)置閾值P＜0.001，曼哈頓圖使用CMplot程序包完成（https://github.com／YinLiLin／RCMplot）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

3年DI結(jié)果的最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)（best linear unbiased prediction，BLUP）采用R版本3.6.1（https://www.r-project.org／）軟件進(jìn)行限制最大似然（REML）分析。利用SPSS 17.0軟件對(duì)小麥黃花葉病發(fā)病指數(shù)進(jìn)行表型數(shù)據(jù)分析。性狀廣義遺傳力計(jì)算公式為為遺傳方差和環(huán)境方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥黃花葉病的抗性鑒定

供試的134個(gè)小麥品種（系）對(duì)小麥黃花葉病的抗性存在明顯差異，并且同一品種（系）在不同年份發(fā)病情況也有一定差異（表1）。其中，抗病品種（系）27個(gè)，占供試材料的20.15%，包括煙農(nóng)0428、煙99603、山農(nóng)18、山農(nóng)17、煙農(nóng)836、濟(jì)麥20、煙農(nóng)999、濟(jì)麥22、良星99、煙農(nóng)21、藁優(yōu)9618、山農(nóng)23、泰農(nóng)18、濟(jì)麥21、954（7）-8、濟(jì)南17、西農(nóng)889、魯麥23、濰麥8號(hào)、LS3283、山農(nóng)25、汶農(nóng)5號(hào)、山農(nóng)21、LS4942、郯麥98、臨旱822、昌樂(lè)5號(hào)；中抗品種（系）21個(gè)，占供試材料的15.67%，分別為陜627、山農(nóng)45、萊州95021、汶農(nóng)6號(hào)、山農(nóng)29、M8008、新麥26、泰山21、魯麥21、泰山24、煙農(nóng)19、山融3號(hào)、石新828、鑫麥289、山農(nóng)664、煙農(nóng)15、魯麥14、石麥15、石家莊8號(hào)、煙5072、山農(nóng)8355；中感、感病品種（系）分別為21、65個(gè)，占供試材料的15.67%、48.51%。

通過(guò)對(duì)134份小麥品種（系）在不同環(huán)境下的病情指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明：變異系數(shù)范圍為87.18%～140.82%，廣義遺傳力為70.65%。方差分析結(jié)果表明，品種（系）間、不同年份間的差異是變異的主要來(lái)源，DI的基因型和環(huán)境效應(yīng)值均在P≤0.001水平差異顯著。

表1 134份小麥品種（系）的黃花葉病抗性表現(xiàn)

表1（續(xù)）

表2 134個(gè)品種（系）在不同環(huán)境下的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

結(jié)果顯示，56個(gè)SNP與小麥黃花葉病病情指數(shù)顯著相關(guān)，分別位于2A（1個(gè)SNP）、2B（4個(gè)SNP）、2D（43個(gè)SNP）、3A（4個(gè)SNP）、4B（1個(gè)SNP）、7B（3個(gè)SNP）染色體上，可解釋8.8%～29.6%的表型變異（圖1，表3）。其中，在2D染色體上檢測(cè)到在3個(gè)環(huán)境和BLUP中均顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記有40個(gè)，占所有關(guān)聯(lián)標(biāo)記的71.4%。根據(jù)SNP遺傳位置［25］，2D染色體的40個(gè)SNP位于76.57～86.28 cM區(qū)間（表3）。

圖1 全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖

表3 與小麥黃花葉病病情指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記

表3（續(xù)）

3 討論與結(jié)論

小麥黃花葉病廣泛發(fā)生于黃淮麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游麥區(qū)等冬小麥主要種植區(qū)域，由于感病品種的種植及農(nóng)業(yè)機(jī)械的跨區(qū)作業(yè)，該病害的發(fā)病面積有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)。選育并推廣種植抗病品種是防治小麥黃花葉病大面積發(fā)生的最有效途徑。本研究連續(xù)3年對(duì)134個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行小麥黃花葉病的抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種（系）對(duì)黃花葉病的抗性差異較大。本研究篩選出抗病品種（系）27個(gè)，包括目前生產(chǎn)上大面積種植和近年來(lái)審定的品種如山農(nóng)18、山農(nóng)17、煙農(nóng)836、煙農(nóng)999、濟(jì)麥22、良星99、煙農(nóng)21、山農(nóng)23、泰農(nóng)18、濟(jì)南17、山農(nóng)25、郯麥98等，建議在小麥黃花葉病主要發(fā)病麥區(qū)（黃淮麥區(qū)北片）推廣種植，也可作為抗病育種的親本材料加以利用。另外，篩選出21個(gè)中抗品種，可以通過(guò)與高抗品種進(jìn)行輪作或者間作，達(dá)到延長(zhǎng)抗病品種使用年限的目的。

本研究利用7 357個(gè)SNP標(biāo)記與3年小麥黃花葉病病情指數(shù)及BLUP值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到56個(gè)與小麥黃花葉病病情指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNPs，分別位于2A、2B、2D、3A、4B、7B染色體上；在2D染色體上檢測(cè)到在3個(gè)環(huán)境和BLUP中均顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記40個(gè)，位于76.57～86.28 cM區(qū)間，表明上述標(biāo)記基因的表達(dá)受環(huán)境影響較小，是穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)。前人的研究也在2D染色體檢測(cè)到抗病位點(diǎn)：如Takeuchi等［26］以高抗品種‘Madsen’和高感品種‘Hokushin’為親本構(gòu)建F2群體，將‘Madsen’的抗病基因YmMD定位于2DL上，位于SSR標(biāo)記wmc041和gwm349之間；Nishio等［8］用高抗品種‘Ibis’和高感品種‘Munstertaler’為親本構(gòu)建DH群體，通過(guò)遺傳分析發(fā)現(xiàn)高抗品種‘Ibis’的抗病基因Ymlb位于2DL上，與SSR標(biāo)記cfd16、wmc41、cfd168和wmc181緊密連鎖；Kobayashi等［12］用高抗品種‘Yumechikara’和高感品種‘Kitahonami’為親本構(gòu)建DH群體，通過(guò)遺傳分析將抗病基因Q.Ymym定位于2D上，與SSR標(biāo)記cfd233和gwm349緊密連鎖。由此可見(jiàn)，2D染色體含有較多抗黃花葉病基因，值得進(jìn)一步深入研究利用。